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Staphylococcus aureus es una bacteria grampositiva con forma de coco, siendo el más importante desde el punto de vista clínico. Está presente en el microbioma habitual de la mucosa nasal en el 20-40 % de los seres humanos1,2 y es el principal agente causal de neumonía y otras infecciones del tracto respiratorio, sitio quirúrgico, prótesis articular e infecciones cardiovasculares, así como de un importante número de casos de bacteriemia nosocomial3. Además, S. aureus puede generar infecciones moderadamente graves de la piel, incluidos forúnculos, abscesos e infecciones de heridas, que por lo general no ponen en riesgo la vida, pero pueden acompañarse de morbilidad y dolor significativos y debido a su frecuencia representan una carga considerable para la salud pública4.
Recientemente las infecciones ocasionadas por S. aureus han adquirido mayor complejidad, como consecuencia de la resistencia antimicrobiana que muchas cepas han adquirido, entre las cuales S. aureus resistente a la meticilina (MRSA, por sus siglas en inglés) es la especie más relevante clínicamente5, cuyos reportes incrementaron ya sea en el ámbito hospitalario como en el comunitario6. Las infecciones por MRSA se acompañan de un aumento de morbilidad, estancia hospitalaria y mortalidad, en comparación a las causadas por cepas sensibles a la meticilina7.
El mecanismo molecular que confiere resistencia a la meticilina consiste en la síntesis de la proteína de unión a penicilina 2a (PBP2a) codificada por el gen mecA, la cual tiene una afinidad extremadamente baja por muchos antibióticos betalactámicos6. S. aureus al desarrollar este mecAnismo de resistencia, adquiere resistencia a antibióticos como penicilinas, cefalosporinas de hasta la cuarta generación y a los carbapenemes8.
Los reportes de resistencia a la meticilina en aislamientos clínicos varían según el país, reportándose tasas de hasta más del 50% en países como Estados Unidos y China9 y del 25,7%, en México10. El primer reporte de MRSA en Sudamérica se dio en el 200511, a partir de allí, diversos reportes se hicieron en todo el continente incluyendo hospitales de Perú con tasas que varían del 27% al 58%12,13.
Conociendo el rol patogénico de S. aureus en las infecciones asociadas a la atención en salud, una identificación errónea de MRSA puede conllevar a consecuencias graves en un centro hospitalario ocasionando fallas en el tratamiento e implicando costos elevados en el mismo; peor aún, generando un riesgo selectivo de resistencia14. Ante esta problemática y debido que, hasta la fecha, los reportes de este tipo de resistencia en el país aún son escasos, el objetivo del presente estudio fue determinar la frecuencia del gen mecA en S. aureus resistente a meticilina aislados de pacientes atendidos en un hospital de tercer nivel, en la región Cajamarca, en el norte del Perú; asimismo, evaluar la utilidad de los discos de oxacilina (OXA) y cefoxitina (FOX) en el screening fenotípico para predecir la presencia del gen mecA.
Materiales y métodos
Aislamientos bacterianos. Se evaluaron 71 aislamientos procedentes de pacientes atendidos en los diferentes servicios del Hospital Regional Docente de Cajamarca, los cuales fueron identificados como S. aureus por el laboratorio de Microbiología de dicho nosocomio, empleando el sistema automatizado MicroScan autoSCAN4. Para la recolección de datos de cada aislamiento de elaboró una ficha, consignándose origen (hospitalario y comunitario), tipo de muestra clínica, sexo y edad del paciente. Los aislamientos bacterianos fueron transportados en cadena de frio, en un rango de temperatura de 2-8 °C, hacia la Universidad Nacional de Cajamarca, específicamente al Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias de la Salud para su determinar su patrón de resistencia fenotípica y la detección molecular del gen mecA.
Detección fenotípica de la resistencia a meticilina. Se sometió a todos los aislamientos a una prueba de tamizaje la técnica de difusión con discos de FOX de 30 μg y OXA de 1 μg, en agar Mueller Hinton, con un inóculo equivalente al tubo 0,5 del nefelómetro de McFarland e incubándolos durante 18 horas a 37 °C. Se estableció que S. aureus era resistente a FOX cuando halo de inhibición del disco tuvo un diámetro menor o igual a 21 mm15, y resistente a OXA cuando el diámetro del halo de inhibición del disco fuese menor o igual a 10 mm16.
Todos los aislamientos con resistencia a alguno de los dos antimicrobianos pasaron al estudio molecular.
Extracción de ADN mediante shock térmico. Del cultivo bacteriano de 18 h de crecimiento, se tomaron tres colonias las cuales fueron suspendidas en 150 μL de agua de grado molecular, se llevaron al vórtex por 5 segundos y se colocaron en baño María a 80 °C durante 10 minutos, y, a continuación se llevó a -20 °C por 10 minutos. Posteriormente se descongeló la muestra y se centrifugó por 8 minutos a 10 000 rpm; se tomaron 60 μL del sobrenadante y se evaluó la pureza del ADN extraído usando un espectrofotómetro de micro-volúmenes, NanoDropTM 2 000 (Thermo Scientific™).
Detección del gen mecA. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con un volumen final de reacción de 50 μL de acuerdo a lo indicado por del kit KOD Hot Start ADN Polymerase (Novagen®, Toyobo, Merck Millipore). Las concentraciones exactas para la PCR fueron de 1 μL de ADN bacteriano, 5 μL de dNTP’s, 5 μL de buffer 10X, 32 μL de agua grado molecular, 1 μL de KOD polimerasa, 1.5 μL de cada primer y 3 μL de MgSO4 25 mM. Las condiciones de PCR consistieron en una activación inicial de la polimerasa a 95 °C por 2 min, seguido de 35 ciclos con desnaturalización inicial a 95°C por 20 s, hibridación de primers a 57 °C por 1 min, extensión a 72°C por 2 min, y una extensión final a 70 °C por 15 s. Los primers fueron el mec1 5-’AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC’-3 y el mec2 5- ’AGTTCTGGCACTACCGGATTTGC’-3 (17). La corrida electroforética del producto (533 pb) se realizó en un gel de 1.5 % de agarosa y con el marcador de peso molecular ADN Ladder 100pb (Life Technologies, Invitrogen™). El gel se corrió a 100 voltios por 30 minutos. Las bandas se evaluaron y fotografiaron a través del transiluminador de luz UV 25 Visi-Blue.
Técnicas de Análisis y Procesamiento de Datos. El análisis estadístico se realizó empleando el paquete estadístico SPSS v.25. La asociación entre las variables (presencia del gen mecA y servicio, tipo de muestra, sexo, edad de los pacientes, resistencia a OXA y a FOX) fue establecida mediante la prueba Chi cuadrado y/o el test exacto de Fisher. La significancia estadística o p-valor se estableció con un p ≤ 0,05 considerando un nivel de confianza del 95 % y error de 5 %. Además, para establecer la utilidad de los discos (FOX u OXA) para predecir la resistencia fenotípica a meticilina con la presencia del gen mecA se utilizó regresión logística binaria.
Resultados
Para el screening fenotípico 49/71 (69,0%) mostraron resistencia a OXA y 43/71 (60,6%) resistencia a FOX; asimismo, la PCR confirmó la presencia del gen mecA en 40/71 (56,3%) de los aislamientos. Respecto al tipo de muestra biológica, 43/71 (60,6 %) correspondieron a secreción bronquial, 10/71 (14,1%) a hemocultivos y 4/71 (5,6%) secreción faríngea y 14/71 (19,7%) a otro tipo de muestras (Tabla 1).
Tabla 1 Características de los aislamientos de S. aureus
| Características | Frecuencias (%) |
|---|---|
| Servicio | |
| Hospitalización | 38 (53,5) |
| Ambulatorio | 33 (46,5) |
| Sexo | |
| Masculino | 42 (59,2) |
| Femenino | 29 (40,8) |
| Muestra Biológica | |
| Secreción bronquial | 43 (60,6) |
| Hemocultivos | 10 (14,1) |
| Secreción faríngea | 4 (5,6) |
| Otros | 14 (19,7) |
| Screening fenotípico de resistencia a meticilina | |
| Resistencia a OXA | 49 (69,0) |
| Resistencia a FOX | 43 (60,6) |
| Sin Resistencia | 22 (31,0) |
| Detección molecular de resistencia a meticilina | |
| Gen mecA + | 40 (56,3) |
| Gen mecA - | 31 (43,7) |
La frecuencia de aislamientos mecA positivos y resistentes a OXA y FOX fue 39/71 (54,9%) y 37 (52,1%) respectivamente. Los aislamientos con la presencia del gen mecA, 22/40 (55%) se aislaron de pacientes hospitalizados y 18/40 (45%) de pacientes de atención ambulatoria. En cuanto al sexo 25/40 (62,5%) fueron hombres y 15/40 (37,5 %) mujeres. La prueba de Chi cuadrado mostró que no hubo asociación entre el tipo de muestra (p = 0,352), el sexo (p = 0,628) y la condición del paciente (hospitalizado o ambulatorio) (p = 0,814) con la presencia del gen mecA. El 14,1 % de los aislamientos MRSA detectados mediante screening con OXA no tenían el gen mecA, mientras que en el 8,5% de aislamientos con resistencia a FOX no tuvieron el gen mecA (Tabla 2).
Tabla 2 Contraste de la detección molecular del gen mecA según el tipo de atención, muestra biológica, sexo y screening fenotípica de resistencia a meticilina.
| Indicador | Detección del gen de resistencia | p valor | |
|---|---|---|---|
| mecA + | mecA - | ||
| Tipo de atención | |||
| Hospitalario | 22 | 16 | 0,814 |
| Ambulatorio | 18 | 15 | |
| Muestra biológica | |||
| Secreción bronquial | 27 | 16 | 0,352 |
| Hemocultivos | 6 | 4 | |
| Secreción faríngea | 2 | 2 | |
| Otros | 5 | 9 | |
| Sexo | |||
| Masculino | 25 | 17 | 0,628 |
| Femenino | 15 | 14 | |
| Screening fenotípico con OXA | |||
| Sensible | 1 | 21 | <0,001 |
| Resistente | 39 | 10 | |
| Screening fenotípico con FOX | |||
| Sensible | 3 | 25 | <0,001 |
| Resistente | 37 | 6 | |
Respecto a la regresión logística binaria, el modelo clasificó correctamente 87,3% de los casos, siendo un modelo aceptable.
El screening fenotípico positivo de resistencia a meticilina con disco de FOX tuvo mayor utilidad para detectar el gen mecA [p = 0,010; Exp(B) = 12,3] en comparación con el disco de OXA (Tabla 3).
Tabla 3 Regresión logística binaria, paso la: análisis de dependencia entre el screening fenotípico con discos de OXA y FOX y presencia del gen mecA.
| B | Error estándar | Wald | gl | Sig. | Exp(B) | 95% CI para EXP(B) | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Inferior | Superior | ||||||||
| Paso 1a | OXA | 2,351 | 1,341 | 3,076 | 1 | 0,079 | 10,500 | 0,758 | 145,359 |
| FOX | 2,512 | 0,971 | 6,688 | 1 | 0,010 | 12,333 | 1,837 | 82,789 | |
| Constante | -7,908 | 2,094 | 14,265 | 1 | 0,000 | 0,000 | |||
a. Variables especificadas en el paso 1: OXA. FOX.
CI: Intervalo de Confianza
Discusión
El método fenotípico llevado a cabo para la detección de MRSA se basa en un screening con antibióticos de OXA y FOX15, estos antibióticos inducen la producción de la proteína PBP2a la cual reemplaza a la proteína nativa en la pared celular18, generando resistencia bacteriana a meticilina, asimismo, la expresión de dicha proteína se ve influenciada por las condiciones de cultivo, afinidad con el antibiótico y por la expresión del gen que codifica dicha proteína, siendo necesario utilizar metodologías confirmatorias como la PCR, la cual es una prueba altamente sensible, que detecta específicamente genes asociados a este mecanismo de resistencia, por lo que se recomienda como el método de detección estándar para la detección de MRSA19,20.
Este estudio constituye el primero de este tipo realizado en un hospital de nivel III de atención en la Región Cajamarca, en el norte del Perú. Encontrándose la presencia del gen mecA en 40 (56,3%) aislamientos de S. aureus, situación que es comparable a lo reportado en diversos estudios21,22; en estudios realizados en Perú se ha reportado frecuencias muy similares a las obtenidos en este estudio13.
El gen mecA se encontró con mayor frecuencia en aislamientos procedentes de hospitalización, lo que implica una elevada frecuencia de MRSA a nivel hospitalario, esto es concordante con la literatura pues los aislamientos de MRSA de ambientes hospitalarios se caracterizan por ser portador del gen mecA13,20; sin embargo, los resultados del presente estudio no mostraron diferencias significativas entre los aislamientos de hospitalización y los de atención ambulatoria, siendo preocupante la alta frecuencia del gen mecA en pacientes que fueron atendidos de manera ambulatoria 18/40 (45%), esto demuestra que las cepas MRSA adquiridas de manera hospitalaria ahora se han extendido a otros entornos de atención médica7, siendo imperativo establecer medidas en los ambientes hospitalarios que interrumpan la transmisión de MRSA y que permitan vigilar los niveles de resistencia a nivel comunitario23. Estos resultados no indican necesariamente que la frecuencia de aislamientos de MRSA detectados a nivel ambulatorio hayan sido adquiridos necesariamente en ambientes comunitarios, este elevado porcentaje debería servir de base para realizar estudios orientados a la detección de gen mecA en MRSA adquiridos en la comunidad23.
Respecto al sexo de los pacientes con aislamientos positivos para MRSA, encontramos mayor presencia del gen mecA en pacientes masculinos, sin embargo, al igual que otros reportes24 se encontró que el sexo no tuvo ningún efecto estadísticamente significativo en la detección de cepas positivas para el gen mecA. En lo concerniente al tipo de muestra obtenida, se encontró con mayor frecuencia el gen en muestras bronquiales, seguidas de hemocultivos, resultados similares fueron reportados en un estudio llevado a cabo en un hospital de otra región de Perú, sin embargo, en dicho estudio gran cantidad de aislados mecA positivos provenían de muestras de secreciones no especificadas13. La elevada proporción del gen mecA de aislamientos de secreciones bronquiales concuerda con otros reportes donde muestran que los pacientes con MRSA aislados en dichas secreciones, tienen más ingresos hospitalarios por año, así como mayor tiempo de hospitalización en comparación a los pacientes con aislamientos sensibles7,25.
Respecto a la detección de MRSA mediante métodos fenotípicos, los resultados mostraron que el screening fenotípico se asocia significativamente a la detección del gen mecA; debido a esto, en distintos laboratorios se utilizan ambos discos de manera convencional para detectar MRSA16,26,27. En este estudio se buscó también evaluar cuál de los dos métodos de screening tiene mayor utilidad para predecir la presencia del gen mecA en los MRSA, la regresión logística binaria mostró que el disco de FOX (30 µg) es de mayor utilidad que el disco de OXA (1 µg); estos hallazgos concuerdan con estudios sobre la utilidad del disco de FOX para detectar MRSA los cuales reportan hasta un 93 % de especificidad superior al 74 % alcanzado con el disco de OXA19,28-30.
Asimismo, como se muestra en la tabla 2, de los 71 aislamientos, 10 (14,1%) fueron resistentes a OXA y no tuvieron el gen mecA, valor superior comparado con los aislamientos FOX resistentes sin el gen mecA, esta elevada proporción de falsos positivos por OXA podría estar influenciada por la hiperproducción de β-lactamasas, dando lugar a la expresión fenotípica de resistencia a la oxacilina pero sin un mecAnismo de resistencia genético, disminuyendo la especificidad del método de screening con disco de OXA29. Esto ha conllevado a que el screening fenotípico de MRSA con disco de OXA deje de utilizarse, y a que el CLSI recomiende el uso de disco de FOX para la detección de MRSA, ya que es un mejor inductor de PBP-2aa codificada por el gen mecA8,15,28, así como mejor inductor del gen mecC6. Adicionalmente al gen mecA, la resistencia desarrollada generada a meticilina puede estar mediada por otros genes como mecB y mecC6,24.
La amplificación del gen mecA mediante PCR se reconoce como la prueba estándar de oro para la detección de MRSA, sin embargo, es un método costoso y no está disponible para la mayoría de laboratorios8,31 siendo poco factible su aplicación como prueba de rutina en la práctica clínica, debido a esto, los laboratorios que no puedan realizar la detección molecular deben utilizar las pruebas de detección fenotípica siendo el disco de FOX una opción útil para detectar la expresión del gen mecA29, basándose en los resultados del presente estudio desaconsejamos el uso del disco de OXA como screening para detección de MRSA mecA positivo.
Una limitación de este estudio fue el tamaño de la muestra, ya el período de recolección fue corto, obteniendo poca cantidad de aislamientos de S. aureus. Además, este estudio no permitió analizar la presencia de aislados MRSA sigilosos, es decir, aquellos positivos a mecA pero que no muestran resistencia a cefoxitina y oxacilina.
En conclusión, el presente estudio encontró un elevado porcentaje de MRSA mecA positivo, principalmente en aislados de pacientes hospitalizados, es importante establecer medidas de vigilancia constante de aislamientos MRSA en todos los hospitales de la región, con la finalidad reducir la propagación entre pacientes y la comunidad, identificar portadores y/o pacientes y seleccionar un tratamiento antibiótico adecuado. Considerando que la detección fenotípica es más accesible para los laboratorios, comprobamos que el screening con disco de cefoxitina es mejor para detectar MRSA mecA positivo.
