ARTÍCULOS INTERNACIONALES

 

Actividad antiprotozoaria in vitro de alcaloides totales de corteza (CAT) de Galipea longiflora Krause Kallunki (evanta) sobre trofozoitos de 2 cepas de Acanthamoeba

 

 

SALAMANCA CAPUSIRI, EFRAIN¹ FLORES, NINOSKA¹ TICONA HUALLPARA, JUAN CARLOS¹ MORALES JACOB, LORENZO² CABRERA-SERRA, MARIA GABRIELA² PIÑERO, JOSE² UDAETA, ENRIQUE¹ CHUQUI, ROGELIO³ GIMÉNEZ, TURBA ALBERTO^1
1 Unidad Parasitología, Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas, Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, Universidad Mayor de San Andrés. La Paz-Bolivia.
² Unidad de Parasitología, Instituto de Enfermedades Tropicales y Salud Publica, Facultad de Farmacia, Universidad de la Laguna. Tenerife-España.
³ Comunidad Santa Rosa de Maravilla (CIPTA)

 

 

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Resumen

Galipea longiflora (Evanta), planta empleada por la medicina tradicional amazónica, ha mostrado en estudios previos presentar actividad antiparasitaria sobre Leishmania, Tripanosomas cruzi, Plasmodium, como también actividad inmunoreguladora. El presente trabajo muestra la actividad antiparasitaria in vitro de los alcaloides totales de corteza de evanta frente a trofozoitos de 2 cepas de Acanthamoeba como son Acanthamoeba castellani Neff y Acanthamoeba polyfaga MN7 los que presentan IC50 de 12.01±0,67μg/mL y 27.34±2,65μg/ mL, respectivamente a través del método Fluorometrico Alamar Blue, siendo estos resultados muy interesantes ya que por un lado se encuentran cercanos a los rangos de inhibición de la clorhexidina y el PHMB, antisépticos tópicos con capacidad antiprotozoaria utilizadas para el tratamiento de queratitis producidas por especies de Acanthamoeba y por otro lado muestra IC50 muy próximos a derivados fosfolipidicos como Miltefosina, Octadecil-PC, Elaidil-PC, reportados y ensayados sobre las mismas especies de Acanthamoebas. Es así que el presente trabajo se constituye en el primer reporte de está especie vegetal frente a protozoarios de la familia Amoebida el cual apoya de forma científica el uso tradicional de corteza de evanta como amebicída y muestra así una alternativa muy prometedora frente a patologías producidas por amebas de vida libre.

Palabras clave

Acanthamoeba, Evanta, Galipea longiflora Alamar Blue, IC50.

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Abstract

Galipea longiflora (Evanta), plant used in Amazonian traditional medicine, has been shown in previous studies to present antiparasitic activity against Leishmania, Trypanosoma cruzi, Plasmodium, as well as immune regulatory activity. The presentwork shows the in vitro antiparasitic activity of the total bark alkaloids, extracted from Evanta, against trophozoites of 2 strains of Acanthamoeba: Acanthamoeba castellani Neff and Acanthamoeba polyfaga MN7, both presentan IC50 of 12.01 ± 0.67 μg/mL and 27.34 ± 2, 65μg/mL, respectively. Using the fluorometric method, with Alamar Blue, and these results very interesting because are near ranges of inhibition showed by chlorhexidine and PHMB, topical antiseptics with antiprotozoal activity, used for treatment of keratitis produced by species of Acanthamoeba, and because shows IC50 very close to phospholipid de-rivatives such as Miltefosine, octadecyl-PC, PC-Elaidil, reported and tested on the same of Acanthamoeba species. Thus, the present work constitutes the first report of activity against the Amoebidae family by this plant species which scientifically supports the traditional use as Amebicide of Evanta bark constituting a promising alternative against diseases caused by freeliving amoebae.

Key words

Acanthamoeba, Evanta, Galipea longiflora, Alamar Blue, IC50.

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INTRODUCCIÓN

Se conoce a las amebas, por lo general, como organismos de forma cambiante, dentro de ellas, hay un grupo, el de las amebas de vida libre, que hasta hace unas décadas, no parecía interesar más que a los especialistas más estrictos y en la actualidad, se sabe que algunos de sus representantes, como son las especies de Acanthamoeba, afectan al hombre y pueden causarle graves patologías (Ortega, 2002).

Las amebas de vida libre del género Acanthamoeba se han aislado en una amplia variedad de hábitat como ser piscinas, conductos de calefacción y de ventilación, suelos, agua mineral embotellada, aire, balnearios, vegetales, sedimentos marinos, lodos procedentes de aguas residuales. Además se han identificado en unidades de diálisis, polvo en suspensión, medios de cultivo de bacterias o células, lentes de contacto donde la mayoría de los casos reportados están asociados a una incorrecta limpieza de las lentes de contacto, empleando soluciones salinas de producción hogareña o el agua de red clorada para el enjuague de las mismas (Morales, 2006; Radford et al., 2002), sus estuches y soluciones para el cuidado de las mismas e, incluso en dispositivos intrauterinos (DIU), haciendo que su contacto con el hombre sea un hecho aparentemente común. Se ha observado que, hasta un 80% de la población, posee anticuerpos específicos frente a Acanthamoeba, siendo aisladas de la nariz y garganta de individuos asintomáticos. (Ortega, 2002; Lorenzo-Morales et al.,2005).

Las patologías que provoca Acanthamoeba están relacionadas con los tejidos que son capaces de colonizar. Pueden invadir el sistema nervioso central, provocando una meningitis denominada Encefalitis Granulomatosa Amebiana (EGA). También pueden encontrarse formando ulceraciones en la piel o invadiendo la córnea, provocando queratitis oculares (Ortega, 2002) que si bien es una patología poco común, en los últimos años ha aumentado su frecuencia asociada, sin duda, al uso de lentes de contacto, especialmente las de tipo blando.(Navarro, 1998). En pacientes inmunodeprimidos, se han descrito casos en los que provocan infecciones diseminadas (Ortega, 2002).

Las actuales medidas terapéuticas para la queratitis producida por Acanthamoeba incluyen una combinación de diaminas y biguanidínas dentro de estas últimas las más activas son la clorhexidina presentando un rango de inhibición in vitro de 0.49-1.9ug/mL y polihexametilenbiguanidina (PHMB) de 0.49-3.9ug/mL (Elder, 1994), siendo tratamientos de larga duración (Navarro, etal 1998; Elder, etal 1994; Seal, 2003) y en muchos casos poco eficases contra las etapas enquistadas del protozoario provocando así infecciones residuales incluso luego del tratamiento (Seal, 2003). No se ha establecido ningún tratamiento eficaz contra la EGA (McBride, et al 2007; McBride, et al 2005) por lo que nace la necesidad y la búsqueda de nuevos agentes antiparasitarios como lo muestran los derivados fosfolipídicos (Miltefosina-Hexadecil-PC, Octadecil-PC, Elaidil-PC, Erucyl-PC, Edelfosina, Perifosina, etc) usados originalmente como anticancerígenos y que recientemente resultaron ser muy activos frente a formas parasitarias de Leishmania, Tripanosoma cruzi, Entamoeba histolytica y especies de Acanthamoeba. (McBride, et al 2005; Papagiannaros, et al 2005; Cabrera-Serra,2007).

La especie medicinal Galipea longiflora es utilizada por las etnias amazónicas: Tacana, Mosetene, Chimanes como antiparasitario (Bourdy, 1999), estudios in vivo e in vitro han demostrado está actividad antiparasitaria frente a diferentes formas y cepas parasitarias de Leishmania (L.donovani, L.braziliensis, L.chagasi, L.amazonensis) (Fournet et al 1993; Caron et al 1993; Fournet et al 1994-1996) como también se ha demostrado su actividad frente a Tripanosoma cruzi (Nakayama, 2001), como su actividad frente a Plasmodium vinckei(Gantier, 1996). Mediante estudios en modelo animal se determino la toxicidad aguda y subcrónica como los parámetros farmacocinéticos para el extracto crudo de esta especie vegetal (Giménez, 2005), y se estableció un sistema de cultivo celular semicontinuo in vitro para células de evanta (Paz, 2007). Recientes estudios muestran el efecto del extracto de alcaloides de evanta sobre la producción de TNF y IFN-y (Calla-Carrasco, 2007). Dada la importancia de está especie vegetal el I.I.F.B viene desarrollando formulaciones farmacéuticas tópicas (pomada) y sistémicas (jarabe) en base a los alcaloides totales de corteza de evanta para el tratamiento de pacientes con leishmaniasis cutanea. Basados en el conocimiento de la medicina tradicional y al amplio estudio científico en base a está especie vegetal es que el presente trabajo pretende demostrar de forma científica el uso tradicional de está especie vegetal como amebicida y así ampliar la actividad antiparasitaria de evanta, demostrando la actividad in vitro de CAT frente a 2 cepas de Acanthamoeba (castellani - polyfaga), responsables de una serie de patologías en el hombre.

 

METODOLOGÍA

Cultivos de Acanthamoeba

Dos cepas fueron utilizadas para este estudio, Acanthamoeba castellani Neff (ATCC30010) cepa tipificada por American Type Culture Collection y un aislado clínico (MN-7) que fue identificado previamente como Acanthamoeba polyphaga.

Las cepas se mantuvieron en crecimiento en medio PYG (0.75 % peptone proteosa (p/v), 0.75 % extracto de lavadura (p/v)) al cual se añadió 1.5% de glucosa (p/v), con 50ug gentamicina (Roche Diagnostics) previamente descrito por Morales (2006).

Obtención de alcaloides totales de corteza de Galipea longiflora Krause Kallunki (Evanta)

El material vegetal (corteza de evanta) seco finamente molido fue macerado por 3 días en CH2Cl2 (10L x 3 veces), en percoladores cónicos de acero inoxidable (diámetro inferior 22cm y diámetro superior 42 x 74cm de alto). El extracto fue filtrado y concentrado a 40oC y secado con una bomba de alto vacío hasta peso constante.

El extracto crudo (50g) fue disuelto en CH2Cl2 (100mL) y sometido a lavados sucesivos con HCl1N (100mL x 3 veces c/u por 30 minutos sobre agitador magnético). Los lavados ácidos fueron controlados con un espectrofotómetro UV, combinados y llevadosa precipitación completa con NaOH 2N (150mL). El sólido formado fue extraído con CH2Cl2 deshidratado con NaSO4, filtrada, evaporada al vacío y secada con una bomba de alto vacío hasta tener un peso constante.

Ensayo de actividad de CAT frente a trofozoitos de 2 cepas de Acanthamoeba castellani

Se tomaron alícuotas de las cajas de cultivos madre de ambas cepas de Acanthamoeba a quienes se determino su población mediante un contador automático.

Ambas cepas de Acanthamoebas fueron sembradas por duplicado en placas de 96 pozos, sembrando 50μL de una solución de 8x103 células/mL, por lo que se tuvo 400 amebas en cada pozo. Se dejo aproximadamente 15 minutos en reposo la placa para que las amebas puedan adherirse al posillo, esto fue comprobado bajo la observación en un microscopio invertido. (Axiovert 25- Zeizz)

Luego se añadió 50 uL de diferentes concentraciones CAT (100μg/mL, 50μg/mL, 25μg/mL, 12,5μg/mL, 6.25μg/mL) disueltas en medio PYG obtenidas a partir de una solución madre (2mg de CAT/200 μL de DMSO), donde la concentración final de DMSO fue < al 1 %. Finalmente se añadió el reactivo de ensayo Fluorométrico Alamar Blue (Biosource, Europe, Nivelles, Belgium) a cada uno de los pozos de placa en una cantidad igual al 10% del volumen final, la placa fue incubada por 120 horas a 28°C con agitación leve. Se realizo la lectura de las placas en un lector de microplacas modelo 680 (Biorad, Hercules, CA) usando un filtro de excitación de 570nm y un filtro de emisión de 630nm.

El porcentaje de inhibición y el 50% de la concentración inhibitoria (IC50) fue calculado por análisis de regresión lineal usando el programa informático sigma Plot 0.9. (Systat Software Inc).

 

RESULTADOS Y DISCUSIONES

La queratitis producida por especies de Acanthamoeba es una afección poco frecuente pero potencialmente grave, las actuales medidas terapéuticas para la queratitis consiste el uso tópico de un conjunto de antimicrobianos, sin embargo muchas veces estos tratamientos no son eficaces contra etapas enquistadas del protozoario y peor aun no existe un tratamiento eficaz frente a la EGA, ante la necesidad de nuevos agentes antiparasitarios en los últimos años se viene realizando estudios de actividad antiparasitaria de derivados fosfolipídicos (Miltefosina-Hexadecil-PC, Octadecil-PC, Elaidil-PC, Erucyl-PC, Edelfosina etc) que fueron inicialmente diseñados como anticancerígenos que a su vez mostraron una excelente actividad antiparasitaria frente a formas parasitarias de Leishmania, Trypanosoma cruzi, Entamoeba histolytica y especies de Acanthamoeba. Es así que los resultados mostrados por CAT son relevantemente buenos en relación a los rangos de inhibición de la polihexametilenbiguanida-PHMB (0.49-3.9μg/mL) y la clorhexidina (0.49-1.9μg/ mL) antisépticos tópicos más eficaces utilizados en queratitis por Acanthamoeba reportados por Elder et.al. (1994), mostrando también una estrecha relación a los IC50 de Miltefosina reportados en estudios previos por Mc-Bride et.al. (2007-2005) como el más prometedor derivado fosfolipidico para el tratamiento de Acanthamoebiasis ensayado sobre las mismas especies de Acanthamoebas, mostrando IC50 de 2.38 y 9.52 μg/mL frente a A.Castellani y A polyfaga repectivamente, coincidiendo estos resultados a la sensibilidad que presenta A castellani a CAT en relación a A.polyfaga.

 

Es conocido el uso tradicional de esta especie vegetal por las etnias Tacanas, Mosetenesy Chimanes de Bolivia, quienes recomiendan usar pedazos de corteza molida de evanta sancochada en tres litro de agua en casos de diarrea con sangre (Bourdy et al 1999), es así y debido a que Acanthamoeba pertenece al mismo orden Amoebida en el cual se encuentra Entamoeba histolyti-ca que es la responsable de una serie de diarreas en nuestro país (Mollinedo, 2006), que el presente trabajo muestra de una forma científica la validación del uso tradicional de esta planta (Evanta) como amebicida.

El presente trabajo muestra de una forma científica el uso tradicional de corteza de evanta como amebicída debido a los resultados de IC50 encontrados de CAT frente a trofozoitos de 2 cepas de Acanthamoeba como son Acanthamoeba castellani Neff y Acanthamoeba polyfaga MN7 los que presentan IC50 de 12.01 ±0,67μg/mL y 27.34±2,65μg/mL, respectivamente mediante el método colorimétrico Alamar Blue, resultados realmente muy interesantes en relación con los rangos de inhibición de los antisépticos tópicos utilizados en queratitis por Acanthamoeba.

Si bien es cierto que los derivados fosfolipidicos responden muy bien frente a protozoarios de la familia tripanosomatidae, edelfosina no presenta actividad frente a Acanthamoeba lo que pudiera indicar que Acanthamoeba

seria susceptible a un rango más limitado de derivados fosfolipidicos, es así que CAT puede llegar a resultar una alternativa prometedora frente a patologías producidas por amebas de vida libre, sin embargo un estudio más detallado quizá por separado de los alcaloides de evanta frente a las diferentes formas del parasito (trofozoitos-quistes) creemos que es importante.

 

AGRADECIMIENTOS

Al Proyecto UMSA-IDH-2012 "Desparasitación de niños en escuelas rurales II". A la agencia AECI, por los proyectos PCI con la Universidad de La Laguna, al IRD Francia por beca de Maestría (SCE), a la Fundación AvH/Stiftung y la OEA, por la donación de equipos. Al CIPTA y la comunidad de Santa Rosa de Maravilla, por la colecta de la especie medicinal.

 

REFERENCIAS

Bourdy, G., Giménez, A., Quenevo, C. (1999). "Tacana: Ecuanasha aquí, ecuanasha ¡d'rene cuana, me schanapaque" (Tacana: Conozcan nuestros árboles, nuestras hierbas).UMSA: IIFB-IIQ-IBBA; FONAMA-EIA; IRD. Plural. La Paz, Bolivia, 411-416.

Cabrera-Serra, G., Lorenzo-Morales, J., Romero, M., Valladares, B., Piñero, J.(2007). In vitro activity of perifosine: A novel alkylphospholipid against the promastigotes stage of Leishmania species. Parasitol Res, 100, 1155-1157.        [ Links ]

Caron, S., Desfossés, S., Dionea, R., Théberge, N., Burnell, R.(1993). Synthesis of some minor quinoline alkaloids found in Galipea longiflora. Journal of Natural Products, 56, 138-139.        [ Links ]

Calla-Carrasco, J., Troye-Blomberg, M., Fernandez, C.(2007) Extracto de alcaloides de Galipea longiflora (Evanta) afecta la proliferación celular y la producción de citoquinas pro-inflamatorias: Factor de necrosis tumoral e interferon-y in vitro. Revista-Biofarbo, 14, 57-66.        [ Links ]

Elder, J., Kilvington, S., Dart, G. A. (1994) Clinicopathological study of in vitro sensitivity testing and Acanthamoeba keratitis. InvestOphthalmolVisSci, 35,1059-1064.        [ Links ]

Fournet, A., Hocquemiller, R., Roblot, F., Cavé, A., Richomme, P., Bruneton, J. (1993) Les chimanines, nouvelles quinoleines substituees en 2, isolees de une plante Bolivienne antiparasitaire: Galipea longiflora. Journal of Natural Products, 56,1547-1552.        [ Links ]

Fournet, A., Barrios, A., Muñoz, V., Hocquemiller, R., Cavé, A., Bruneton, J.(1993).2-Substituted quinoline alkaloids as potential antileishmanial drugs. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 37, 859-863.        [ Links ]

Fournet, A., Gantier, JC., Gautheret, A., Leysalles, L., Munos, H., Mayrargue, J. (1994). The activity of 2-substituted quinoline alkaloids in Balb/c mice infected with Leishmania donovani. Journal Antimicrobial Chemotherapy, 33, 537-544.        [ Links ]

Mollinedo, S., Prieto, C. (2006). El entero-parasitismo en Bolivia (1975-2004). Ministerio de Salud y Deportes de Bolivia, 29-34.        [ Links ]

Morales,J. (2006). Estudios Epidemiológicos y Moleculares del Género Acanthamoeba en Regiones Tropicales y Subtropicales, Tesis Doctoral, Instituto Universitario de Enfermedades Tropicales y Salud Pública de Canarias, España. 19-20.        [ Links ]

Nakayama, H., Ferreira, M., Rojas de Arias, A., Bilbao, S., Schinini, Alicia., Fournet, A. (2001). Experimental Treatement of cronic Tripanosoma cruzi infection in mice with 2-N-Propylquinoline. Phytotherapy Research, 15, 630-632.        [ Links ]

Navarro, J., Zarco, D., Lorduy, L., Alemán, R.(1998) Queratitis por Acanthamoeba: A propósito de un caso bilateral. Farm Hosp, 22 (5),253-255.        [ Links ]

Ortega, A. (2002). Aplicación de la técnica de Rapd para la caracterización de especies de género Acanthamoeba, Tesis Doctoral Universidad de la Laguna, España. 1-6.        [ Links ]

Fournet, A., Ferreira, E., Rojas, A., Torres, S., Fuentes, S., Nakayama, H., Schinini, A., Hocquemiller, R.(1996). In vivo efficacy of oral and intralesional administration of 2-substituted quinolines in experimental treatment of new world cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania amazonensis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 40, 2447-2451.        [ Links ]

Fournet, A., Barrios, A., Muñoz, V., Hocquemiller, R., Roblot, F., Cavé, A., Richomme, P.(1994). Antiprotozoal activity of quinoline alkaloids isoleted from Galipea longiflora, a Bolivian plant used as a treatmet for cutaneous leishmaniasis. Phytotherapy Research, 8,174-178.        [ Links ]

Gantier, J., Fournet, A., Muños, M., Hocquemiller, R. (1006). The effect of some 2-substituted quinolines isolated from Galipea longiflora on Plasmodium vinckei petteri infected mice. Planta médica, 62, 285-286.        [ Links ]

Giménez, A., Avila, J., Ruiz, G., Paz, M., Udaeta, E., Ticona J, Salamanca E. (2005). Estudios químicos, biológicos y farmacológicos de Galipea longiflora, Krause. Revista Boliviana de Química, 22, 94-107.        [ Links ]

Lorenzo-Morales, J., Monteverde-Miranda, C., Jiménez, C., Tejedor, M., Valladares, B., Ortega-Rivas, A. (2005). Evaluation of Acanthamoeba Isolates from Environmental Sources in Tenerife, Canary Islands, Spain. Ann Agric Environ Med, 12, 233-236.        [ Links ]

McBride, J., Mullen, A., Carter, Ch., Roberts, W. (2007). Differential cytotoxicity of pathogenic Acanthamoeba species and mammalian cells. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 60, 521-525.        [ Links ]

McBride, J., Ingram, P., Henriquez, F., Roberts, W.(2005). Development of colo-rimetric microtiter plate assay for assessment of antimicrobials against Acanthamoeba Journal of Clinical Microbiology, 43(2), 629-634.        [ Links ]

Papagiannaros, A., Bories, C., Demetzos, C., Loiseau, P.(2005) Antileishmanial and Trypanocidal activities of new miltefosine liposomal formulations. Biomedicine y Pharmacotherapy, 59, 545-550.        [ Links ]

Paz, M., Vázquez, F., Chuqui, R., Paredes, C., Sauvain, M., Gimenez, A.(2007) Establecimientos de cultivos in vitro de Galipea longiflora una Rutacea de la Amazonia Boliviana. Acta Farm.Bonaerense, 26,15-19.        [ Links ]

Radford, C., Minassian, D., Dart, J. (2002) Acanthamoeba keratitis in England and Wales: incidence, outcome, and risk factors. Br J Ophthalmol, 86,536-542.        [ Links ]

Seal,V. (2003) Acanthamoeba keratitis update-incidende,molecular epidemiology and new drugs for treatment. Eye, 17, 893-905.        [ Links ]