INTRODUCCIÓN

Las Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA), son causadas por la ingestión de microrganismos vivos perjudiciales para la salud, constituyen una de las causas de morbilidad y mortalidad a nivel mundial, principalmente en países cuyas economías son más precarias. Estas enfermedades se pueden convertir en un problema de salud pública, ya que generan un impacto negativo en la sociedad y en los sistemas de atención de salud, ocasionando el deterioro de la calidad de vida de la población, la productividad, el comercio y el turismo (1-3).

Las ETAs son generalmente de carácter infeccioso o tóxico causadas por bacterias virus o parásitos que penetran al organismo a través de los alimentos contaminados. Producen diversas dolencias y enfermedades que pueden ir desde manifestaciones gastrointestinales hasta el cáncer (2,4). La contaminación de los alimentos puede darse en cualquier etapa del proceso desde la producción hasta el consumo de los mismos. Se estima que cada año mueren 1,8 millones de personas debido a enfermedades diarreicas atribuidas al consumo de agua o alimentos contaminados con microorganismos patógenos (1, 5-7) En Ecuador el Ministerio de Salud Pública a través de la Dirección Nacional de Vigilancia Epidemiológica, reportó 2207 casos por intoxicación alimentaria, para la semana 11 del año 2021, los cuales en su mayoría fueron reportados en la Provincia de El Oro, con 1253 casos (⁸).

En consecuencia, es importante vigilar la calidad alimentaria de la leche cruda de vaca; ya que, por ser una sustancia rica en proteínas, lípidos y micronutrientes puede convertirse en un caldo de cultivo idóneo para la multiplicación de microrganismos (1,6). El control de este alimento se rige por la Norma Técnica Ecuatoriana (⁹), la cual establece los requisitos que se deben cumplir, tanto en la obtención, transporte y conservación; entendiendo por leche cruda como la leche que no ha sufrido tratamiento térmico, salvo el de enfriamiento para su conservación, ni ha tenido modificación alguna en su composición (6,9).

En esta investigación para determinar los parámetros de calidad de la leche cruda, se empleó la Norma INEN 0009:2012 predestinada a la pasteurización. Está norma es empleada únicamente en leche fresca recién recolectada del ordeño, que no ha sido sometida a un proceso térmico. Sin embargo, es permitido emplear enfriamiento para conservar la leche de su descomposición. Dentro de los parámetros de calidad que se pueden medir en la composición de la leche cruda, se destacan los parámetros fisicoquímicos cualitativos como el color, aspecto y olor de la leche, y también están los cuantitativos como temperatura, densidad, pH, acidez y presencia de antibióticos (9, 10).

La leche cruda se caracteriza por ser un producto homogéneo de olor y sabor agradable, de color blanco opalescente, aspecto homogéneo, libre de bacterias y materias extrañas. Los valores para la densidad a 20℃ deben oscilar entre 1028 y 1032 g/cc y el pH entre 6,4 y 6,8. Asimismo, el límite aceptado de concentración de Staphylococcus aureus es de 10 Unidades de Formación de Colonias por ml de muestra (10 UFC/ml). Al cumplir con los parámetros establecidos por la normativa (⁹) del Instituto Ecuatoriano de Normalización, será aceptado como un producto de buena calidad para el consumo humano (11-13).

Con respecto a las medidas que se deben cumplir, la leche debe ser almacenada y conservada a una temperatura de 4°C, con el fin de controlar la proliferación del crecimiento bacteriano. También el acarreo y transporte debe ser en vehículos adecuados, preferiblemente refrigerados, sin tener interrupciones ni paradas innecesarias (9,14,15). Otro aspecto importante que asegura la calidad alimenticia de la leche es la aplicación de las medidas higiénicas en las vaquerías o lugares de ordeño, se pueden mencionar: la limpieza y desinfección de la sala de recolección, el uso de agua potable para la limpieza de equipos y utensilios, esterilización de los recipientes para la recolección y almacenamiento, control de la presencia de insectos como las moscas, uso de barreras físicas, tales como mascarillas, gorros y guantes, por parte de los ordeñadores (14,15-19).

En este orden de ideas, es importante destacar que la falta de higiene por parte del personal que interviene en el ordeño, almacenamiento, transporte o comercialización de la leche puede deteriorar su calidad higiénico sanitaria favoreciendo la contaminación por la presencia de bacterias aerobias mesófilas, coliformes totales y Staphylococcus aureus (¹⁴). Por consiguiente, la presencia de microorganismos en la leche cruda además de contaminar y causar daños a nivel de la salud, también provoca grandes pérdidas en las ganaderías lecheras (3,5,20,21).

Las bacterias Gram positivas como el género Staphylococcus son los patógenos con mayor índice de ETAs. Los estafilococos, son bacterias de forma esférica, inmóviles, positivas a las pruebas de coagulasa y catalasa, anaerobios facultativos que forman parte de la microbiota natural de la piel, fosas nasales, del tracto urogenital y también del tracto digestivo tanto en el ser humano como en los animales (22,23). Se conoce que este género de bacterias presenta 45 especies y 21 subespecies los cuales se pueden clasificar de acuerdo a dos grupos, los que pueden producir la enzima coagulasa: estafilococos coagulasa positivos (CoPs) como por ejemplo S. aureus y los estafilococos coagulasa negativos (CoNS) dentro de los cuales esta S. epidermidis, S saprophyticus, y S. Lugdunensis (23-26). Comúnmente estas bacterias se cultivan en medios selectivos o diferenciales a una temperatura de 35 a 37°C durante 18 a 24h para garantizar un crecimiento óptimo (24-27).

Entre estos microrganismos el Staphylococcus aureus es el que se presenta con mayor prevalencia en la leche; alterando su composición descendiendo su pH entre 4.3 -y 4.5. Por tanto, es considerado como un agente patógeno causante de mastitis bovina, infecciones superficiales y crónicas, y enfermedades gastrointestinales en seres humanos (15, 22). Por esta razón el aislamiento e identificación del S. aureus es de gran interés para la industria láctea en Ecuador, con el fin de prevenir brotes de ETAs, ya que la detección a tiempo en el ambiente, materia prima o producto terminado se convierte en la posibilidad de garantizar un alimento seguro e higiénico y así evitar problemas de salud a la población (²⁰).

Cabe destacar, que en este país la producción lechera representa una fuente de ingresos para casi 1,2 millones de personas. Esto indica que la industria láctea representa alrededor del 4% del PIB Agroalimentario del país, teniendo un gran impacto económico y un alto potencial de exportación (28,29). Entre los 299.000 productores de leche ecuatorianos, un 80% son granjas pequeñas, familiares y solo un 20% granjas medianas y grandes. Apenas 4% de los productores está tecnificado y reporta alta productividad (²⁰). Por tanto, es de importancia mantener la calidad de la leche para asegurar el crecimiento de este sector económico.

Por lo antes planteado la investigación se ejecutó en una muestra de cinco vaquerías ubicadas en el cantón Chilla en la provincia de El Oro en Ecuador, y se trazó como objetivo identificar bacterias patogénicas Gram positivas, presentes en la leche cruda de vaca obtenida por ordeño manual; utilizando técnicas enzimáticas y microbiológicas para su aislamiento e identificación.

MÉTODO

De acuerdo al objetivo se clasifica como una investigación descriptiva con un diseño de campo, longitudinal y contemporáneo. La población estuvo constituida por cinco vaquerías ubicadas en el Cantón Chilla en la provincia de El Oro en Ecuador, cada productora de leche se encuentra separada por una distancia mínima de 1000 metros, el total de vacas fue de 41 individuos. Por muestreo aleatorio se obtuvieron 20 muestras de leche, cada una de 150 ml, estas muestras fueron recolectadas del ordeño manual realizado en las vaquerías desde las 5:00 hasta las 7:00 de la mañana, durante los meses de junio y julio, en el año 2023. Una vez recolectadas las muestras, se aplicó la normativa INEN 1 529-2:99 (³⁰) para el manejo y transporte; bajo los mismos estándares, el procesamiento se realizó en el Laboratorio de Microbiología y Parasitología, de la facultad de Ciencias Químicas y de la Salud de la Universidad Técnica de Machala.

Para la detección e identificación de las bacterias Gram positivas se aplicaron métodos de dilución, caracterización, prueba bioquímica enzimática y tinción de Gram. Por consiguiente, se utilizaron los materiales necesarios para la siembra y cultivo de microorganismos; así como también, los equipos para la preparación de las muestras, incubación, detección e identificación de microorganismos.

Procedimiento: Además de los métodos y técnicas empleados para la recolección y transporte de la muestra según la normativa INEN 1 529-2:99, se siguieron los protocolos para el análisis microbiológico según normativa NTE INEN 9:2012 Y NTE INEN 1529-5:2006 (9, 30).

La recolección de las muestras de leche cruda se hizo en recipientes estériles, debidamente rotulados, los cuales se transportaron con temperaturas de 0 a 4℃. Los medios de cultivo utilizados fueron el Caldo Lactosa fabricado por MCDLAB y el Agar Manitol Salado obtenido del Laboratorio Clínico “Dra. Cecilia Valverde”, los cuales fueron preparados de acuerdo a los procedimientos estandarizados. Para la siembra se utilizó la técnica de aislamiento por banco de cinco diluciones sucesivas, a saber 1/10, 1/100/, 1/1000/, 1/10000 y 1/100000. Cada dilución se sembró en caldo de cultivo de lactosa e incubados a 37℃ durante 24 horas (¹⁷). Los procedimientos de identificación de los microorganismos fueron tres: Aislamiento de colonias por agotamiento, en cajas de Petri; prueba bioquímica de coagulasa y la tinción de Gram (23, 27,31)

DESARROLLO Y DISCUSIÓN

Las características fisicoquímicas de las muestras de leche, de acuerdo a la normativa NTE INEN 9:2012, aluden al pH y la densidad, estos resultados se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1 Características fisicoquímicas de las muestras de leche cruda 

La Tabla 1 muestra la calidad fisicoquímica de la leche cruda, con respecto al pH y densidad, todas las muestras en las respectivas vaquerías presentan un pH entre 6,42 a 6,78 y una densidad entre 1,028 a 1,031. Lo que significa que la calidad fisicoquímica de la leche cruda de vaca se encuentra dentro de los límites establecidos por la normativa NTE INEN 9:2012. Al respecto, Brousett (³²) y López y Barriga (³³), mencionan que cuando el pH de la leche está fuera de los rangos permitidos por la normativa, es por efecto de contaminación microbiana, dado que estos microorganismos transforman la lactosa en ácido láctico, bajando los valores del pH. También puede ocurrir un cambio en el pH por mantener el producto a temperaturas superiores a los 20°C. Esto no quiere decir que las muestras de leche no pudieran estar contaminadas, sino que el tiempo de reproducción de las bacterias no ha transcurrido.

Las características cualitativas de las diluciones de las muestras de leche son el olor, la turbidez, la producción de gas y la presencia de un precipitado. Así mismo el color, la consistencia y el borde de las colonias son características empleadas para la identificación de las colonias de microorganismos. Estas se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2 Características cualitativas por dilución de muestra 

En la Tabla 2 se muestra que en todas las vaquerías se observó presencia de turbidez, gas y precipitado en las diluciones 1/10, 1/100 y 1/1000; así mismo, en sus colonias presentaron un color amarillo con halo de este color, consistencia untuosa y borde liso. De forma específica en las vaquerías 1, 2 y 5, fue positiva la presencia de microorganismos en las diluciones 1/10, 1/100 y 1/1000, y negativa en las restantes. Las muestras de la vaquería 4, fueron positivas a la presencia de microorganismos hasta la dilución 1/10000 y la vaquería 3 resultó positivo en todas las diluciones desde 1/10 hasta 1/100000. Esto significa que existe mayor concentración de microrganismos en las muestras de leche cruda proveniente de la vaquería 3, ya que se observó el desarrollo de las colonias en todas las diluciones. Sin embargo, estos resultados no son concluyentes con el tipo de microorganismo.

En este orden de ideas Ramírez et al. (³⁴) refieren que los medios de cultivos tanto líquidos como sólidos, son un conjunto de nutrientes necesarios para el desarrollo de microorganismos. De acuerdo a la concentración del inóculo, el desarrollo de las bacterias va aumentar o disminuir de manera directamente proporcional; a mayor concentración mayor será el crecimiento bacteriano y si la concentración es baja tendrá un menor crecimiento. Las diluciones para este estudio se realizaron en caldo lactosa, las características que deberían presentar son turbidez, precipitado y gas, para indicar el crecimiento de microorganismos, pero no se puede especificar la bacteria que se está desarrollando ya que es una prueba presuntiva (Ver Figura 1A). En la Figura 1B el tubo presenta el líquido transparente libre de crecimiento bacteriano.

Figura 1 Características cualitativas de las diluciones 1/10 y 1/100000 en la vaquería 2 

Una vez realizadas las lecturas de las características cualitativas en las cinco diluciones por cada muestra, se procedió al conteo de colonias aisladas en medio de cultivo agar manitol salado, el cual se utilizó como un medio selectivo para el aislamiento de estafilococos patógenos, especialmente el Staphylococcus aureus, los resultados en la Figura 2.

Figura 2 Desarrollo de las Unidades de Formación de Colonias 

La siembra se realizó por duplicado a partir de las cinco diluciones para las 20 muestras de leche. En la Figura 2 se observa que las muestras provenientes de la vaquería 4 presentan mayor cantidad de Unidades Formadoras de Colonias de S. aureus por mililitro de muestra (UFC/ml). En la dilución 1/10 el recuento de UFC fue de 98 y en las vaquerías 1, 2, 3 y 5 no sobrepasaron de las 45 UFC. En la dilución 1/100000, las muestras de la vaquería 4 fueron las únicas en las cuales aparecieron 38 colonias, esto en comparación con las muestras provenientes de las otras vaquerías, las cuales no desarrollaron colonias en esa dilución. El recuento de organismos mesofílicos es una medida de las condiciones de higiene en la producción de leche, donde el valor de 10.000 UFC/ml es considerado para indicar que la leche es de buena calidad, por encima de estos valores no es recomendable el procesamiento ni el consumo del producto (⁹).

Para el cultivo de los microorganismos se prepararon suspensiones con solución salina estéril. Se realizó la siembra por estriado en agar manitol salado, como el medio selectivo y diferencial para el aislamiento de Staphylococcus aureus, las cápsulas de Petri fueron incubadas a 27 ℃ durante 24 horas. En la figura 3 se evidencian las colonias de color amarillo en el lado A y el agar limpio sin colonias en el lado B. Al respecto, Durán Vila et al. (³⁵), reportan que cuando existe el desarrollo de colonias de S. aureus, es porque este tipo de bacterias son fermentadoras del manitol y por ende va a producir acido en el medio de cultivo, permitiendo la formación del halo de color amarillo alrededor de las colonias.

Figura 3 Siembra en agar manitol. A: desarrollo de colonias de S. aureus B: Ausencia 

El recuento elevado de S. aureus en las muestras de la vaquería 4 pudo tener diversos factores contaminantes como la presencia de lodo, heces del ganado, inadecuado empleo del equipo de bioseguridad por parte de los ordeñadores, calidad del agua para el lavado de utensilios y desinfección de la ubre bovina; sin embargo, no se logró determinar cuál o cuáles fueron los causantes. De acuerdo a la normativa NTE INEN 9, el límite aceptado de concentración de S. aureus es de 10 UFC/ml, por consiguiente, las muestras de leche de las vaquerías 4 y 1 no son aptas para su procesamiento y consumo.

Estos resultados coinciden con los reportados por la investigación de Saltos Solórzano et al. (³⁶) en la cual el análisis de las muestras de leche fue positivo para Staphylococcus aureus, con un conteo de colonias entre 120 y 13 UFC/ml, en las diferentes diluciones para la siembra. Concluyendo que todas las muestras estuvieron fuera del rango de aceptación del producto de acuerdo a la Norma NTE INEN 15. Para reducir la contaminación por S. aureus los investigadores implementaron Procedimientos Operacionales Estandarizados (POE) y Procedimientos Operacionales Estandarizados de Sanitación (POES) como prácticas para prevenir la contaminación de la leche, estos redujeron notoriamente la presencia de Staphylococcus aureus.

Asimismo, diferentes investigaciones de análisis microbiológico de leche cruda obtenida por ordeño manual, como las de Martínez-Vasallo et al., (¹⁸) Albuja Landi et al., (¹⁹), Pacha et al., (²⁴) y Jaramillo Colorado et al. (³⁷), coinciden en reportar la presencia de Staphylococcus aureus, superiores a 10 UFC/ml en las primeras tres diluciones de las muestras. Como causas de la contaminación por este microorganismo mencionan las malas prácticas de higiene durante la rutina de ordeño, uso inadecuado de barreras físicas como la mascarilla y guantes, y carencias en la desinfección en el lugar de ordeño.

A continuación, se reporta el resultado del tamaño desarrollado por las colonias de S. aureus en las diferentes diluciones de las muestras como otra característica cuantitativa, Figura 4

Figura 4 Tamaño de las colonias de S. aureus. 

La Figura 4 permite determinar que las colonias de Staphylococcus aureus presentaron ciertas diferencias en cuanto al tamaño, el máximo fue de 0,35 mm y mínimo de 0,075 mm. El tamaño de las colonias puede ser afectado por el tiempo de incubación y la concentración bacteriana en la siembra (23, 26). Es decir que, si el asa de platino no estuvo tan cargada de muestra, al momento de hacer el estriado en el medio de cultivo no iba a crecer de la misma manera que una siembra bien cargada. Con el objetivo de confirmar el tipo de especie de Staphylococcus aislado en el en el medio de cultivo, se realizó la prueba de coagulasa (17, 23), los resultados se pueden observar en la Figura 5.

Figura 5 Prueba Bioquímica de Coagulasa 

La Figura 5 evidencia resultados positivos a la prueba de Coagulasa, en todas las muestras, las colonias aisladas en agar manitol fueron características de Staphylococcus aureus. Al respecto Pasachova Garzón et al., (²²) en su investigación mencionan que para confirmar el tipo de Staphylococcus que creció en agar manitol, se debe realizar la prueba bioquímica de coagulasa, la cual con un resultado positivo se comprueba que la bacteria aislada pertenece a la genero Staphylococcus y a la especie aureus. Esto se debe a la producción de la enzima estafilocoagulasa que actúa como un agente activo en la coagulación que convierte el fibrinógeno en fibrina. Esta prueba distingue la bacteria S. aureus de las otras especies como lo son la S. epidermidis, S. lugdunensis y S. saprophyticus ya que estas bacterias al no producir esta enzima, son denominadas estafilococos coagulasa negativos.

Finalmente, se realizó la tinción de Gram para corroborar el género y especie de la bacteria, resultados que se ilustran en la Figura 6.

La Figura 6 muestra una tinción de Gram positiva, ya que las bacterias retuvieron el color violeta. La parte A es una vista microscópica con un aumento de 400X y la parte B de 1000X. Está técnica permitió confirmar la presencia de Staphylococcus aureus en las muestras de estudio. Al respecto Cervantes-García et al. (²⁵) indican que si las bacterias conservan la coloración cristal violeta se denominan Gram positivas y si la pierden se denominan Gram negativas; la tinción de Gram se debe realizar con cultivos frescos no mayor a las 24 h, puesto que un cultivo pasado este tiempo hace que las bacterias pierdan la capacidad de retener el colorante primario.

De acuerdo a los resultados obtenidos las muestras de la leche cruda presentan recuentos elevados de S. aureus, por lo tanto, no cumplen con la normativa NTE INEN9:2015 (³⁸). El consumo de este producto puede provocar daños en la salud del consumidor. Al respecto, Jaramillo Colorado et al (³⁷) manifiestan que el S. aureus es una bacteria patogénica causante de intoxicación alimentaria y al consumir una leche contaminada por este tipo de bacteria traerá consigo problemas gastrointestinales manifestados como dolor abdominal, náuseas, vómitos, diarrea y deshidratación en casos severos. Mientras que en casos más graves se puede presentar síntomas tales como cefalea y colapso intestinal.

CONCLUSIÓN

Se identificó en las muestras de leche cruda obtenida por ordeño manual, provenientes de las vaquerías del Cantón Chilla la presencia de la bacteria Stapylococcus aureus de forma predominante con respecto a otras bacterias. En una de las vaquerías se obtuvo una carga microbiana muy elevada, lo que indica que la leche no tiene buena calidad higiénica en relación a las Normas Técnicas ecuatorianas. Las causas de la contaminación de la leche cruda de vaca con S. aureus pueden ser las inadecuadas prácticas de ordeño y las escasas condiciones higiénicas en los ambientes de las cinco unidades productoras de leche y en los utensilios de recolección y transporte.

CONFLICTO DE INTERESES

Los autores declaran que no existe conflicto de intereses para la publicación del presente artículo científico.

FINANCIAMIENTO

Los autores declaran que no recibieron financiamiento