INTRODUCCIÓN
U. urens L. es una planta anual, crece de 10-50 cm de alto (Burkart, 1987), es una planta vivaz, sin látex con tallos estriados suculentos provistos de pelos urticantes delgados esparcidos en ambas caras. La acción urticante se debe al líquido contenido en los pelos que se libera al romperlos. (Bruneton, 1999; Torrico, 1994; Zalles y De Lucca, 1991).
La característica más relevante de las ortigas es poseer pelos urticantes, según varios estudios (Wagner y col., 1994; Collier y col., 1956; Emmelin y col., 1949) estos pelos contienen en su composición histamina, ácido fórmico, acetilcolina, ácido acético, ácido butírico, leucotrienos, 5- hidroxitriptamina. Se han aislado de diferentes especies de urticas y por diferentes métodos varios compuestos, entre ellos los glicósidos (Feng y col., 2011), lignanos (Yan y col., 2008; Zhou y col., 2009), polisacáridos (Li y col., 2009), flavonoides como la isovitexina, isoquercitrina, astragalina, afzelin y quercitrina, también se conoce que en U. dioica conocida como urtica mayor se identifico el flavonoide 5,2´,4´-trihidroxi-6,7,8,5`-tetrametoxiflavona, ácido clorogénico y 2-O-cafeoilmalico, β-sitosterol (Aishan y col., 2010; Chaturvedi, 2001; Pinelli y col. 2008, Berges y col., 1995). En el aceite esencial de U. dioica se identificaron 43 compuestos que representan el 95.8% del aceite, entre los principales componentes de este aceite se encontraron el carvacrol, carvona, naftaleno, E-anetol, hexahidrofarnesil acetona, E-geranil, E-β-ionona y fitol (Süleyman y col., 2012). La composición de una fracción lipofílica de U. urens L. estudiada por Lapinskaya y Kopyt´ko (2008) reporto la presencia de vainillina, ácido palmítico, ácido linoléico, ácido linolénico, escualeno, β-sitosterol, β-tocoferol, y etil ester de ácido palmítico. Otros constituyentes presentes en esta especie vegetal son el ácido 13-hidroxioctadecanotrieno, la escopoletina, sitosterol y su glucósido, además de una proporción elevada de clorofilas A y B.
La comercialización de Urtica urens L. cada vez mas alta, y tiene un amplio consumo como planta seca y/o deshidratada, en combinaciones de diferentes partes de la misma planta o en combinaciones con diferentes especies vegetales.
La identificación mediante métodos fisicoquímicos, recolección, desecación y almacenamiento de esta especie vegetal se convierte en un problema a la hora de caracterizar la droga, detectar adulteraciones, como la sustitución y/o falsificación, reconocer si la muestra es diferente a la descrita, si la recolección y almacenamiento fueron correctos, además determinar el grado de contaminación. Resulta entonces un requisito indispensable contar con la determinación de los parámetros de calidad de Urtica urens L. que permita potenciar el uso de la materia prima de la especie para realizar investigaciones hacia preparaciones farmacéuticas, formulaciones magistrales.
MATERIAL Y MÉTODOS
Material vegetal.
La especie vegetal U. urens L. fue recolectada en el Departamento de La Paz, Provincia Ingavi, sexta sección Jesús de Machaca, Cantón Chama a 110 km de la ciudad de La Paz ubicada a 68º 50´00´´ longitud Oeste, 16º45´00´´ latitud Sur. La autentificación de U. urens L. (Voucher Nº1) se realizó en el Herbario Nacional de Bolivia (LPB) a cargo del botánico Javier Quisbert.
Análisis de las características organolépticas
Se analizó olor, color, sabor, condición y textura en la droga pulverizada.
Análisis micrográfico
Se utilizó la muestra reducida a polvo y se la examinó en el microscopio, utilizando agua e hidrato cloral como aclarantes, y fluoroglucina clorhídrica para la coloración de tejido lignificado (coloración rosa).
Determinación del contenido de humedad
Se realizó por el método directo, en una balanza de humedad (AND-MX50) con 1g del material vegetal pulverizado.
Determinación de cenizas totales
Se carbonizó 2g de material vegetal, luego se incineró la muestra por dos horas en un horno mufla a 550ºC (Wise Therm FHP-03).
Determinación de cenizas ácidas
A las cenizas totales obtenidas en la anterior determinación, se añadieron 2-3 ml de ácido clorhídrico al 10%, se calentó en un baño de agua hirviendo por 10 min, la solución se filtró, se añadió solución de nitrato de plata, para precipitar cloruros, el papel filtro se secó a 105ºC y se transfirió al crisol original, se procedió de la misma manera que para la determinación de cenizas totales.
Determinación de cenizas solubles en agua
Se tomaron las cenizas totales obtenidas anteriormente y se le añadieron 15 a 20 ml de agua, esta solución se hizo hervir durante 5 minutos, y se procedió de la misma manera que para la determinación de cenizas totales.
Determinación de materia extraña
Se utilizaron muestras de 100g que esparcieron sobre un papel, se separaron las materias extrañas, se pesó la materia extraña y se determinó el porcentaje en base a la muestra utilizada.
Índice de hinchamiento
Se llevó 1g de muestra a una probeta, se humedeció la muestra con alcohol, y se añadió 25 ml de agua destilada y se agito cada 10 minutos durante una hora, se dejó en reposo por cuatro horas, finalmente se midió el volumen ocupado por la muestra incluyendo el mucílago.
Preparación de los extractos: etéreo, diclorometánico, etanólico y acuoso
La obtención de los extractos orgánicos se realizó por percolación en frío mediante el procedimiento de polaridad creciente por extracción sucesiva con éter de petróleo, diclorometano y etanol. Se emplearon 300g de material vegetal seco y pulverizado, el total de los líquidos extractivos se concentraron en un rotaevaporador (Heidolph Labarota 4000 digital) a presión reducida y temperatura controlada hasta la obtención de un extracto de consistencia pastosa que se dejó secar a temperatura ambiente, bajo protección de la luz. Para la obtención de los extractos acuosos, se procedió a verter agua destilada sobre el recipiente que contiene la planta pulverizada libre del último solvente (etanol), se tapó y se mantuvo así por un periodo de dos horas, posteriormente se filtró y se sometió a un proceso de liofilización (Christ ALPHA2-4 LO plus).
Determinación de la composición cualitativa de grupos mayoritarios de moléculas en los extractos de Urtica urens L. mediante la técnica Screening Fitoquímico.
Para la determinación de grupos de compuestos presentes en los extractos acuoso, etanólico, diclorometánico y etéreo se realizó un screening fitoquímico cualitativo (tabla 1), mediante reacciones colorimétricas y de precipitación en tubos de ensayo.
Metabolito | Reacción de identificación | Color/precipitado | Resultado |
Taninos Saponinas Cumarinas | Gotas de cloruro férrico al 3% sobre el extracto Agua sobre el extracto más agitación Reactivo de Bontraguer Reacción de Shinoda Reacción de Mayer Reacción de Dragendorff Reacción de Wagner | Precipitado color negro azulado (taninos gálicos) Marrón verdoso (taninos catéquicos) Formación de espuma Coloración azul | + + + |
Flavonoides Alcaloides Alcaloides Antraquinonas | Coloración anaranjada o roja Precipitado blanco Coloración naranja Coloración amarilla | + + + + | |
Perfil cromatográfico de los extractos
Una solución de la muestra se aplicó por medio de un tubo capilar sobre la placa cromatográfica, superficie del adsorbente inerte silicagel de 10 x 6cm x 2mm de espesor, 60 F254 (Merck) utilizando como eluyente la fase móvil tolueno:acetona (8:2), éter:acetona (9:1) en estas fases se separaron los extractos etéreo y de diclorometano; fase móvil tolueno:cloroformo:acetona (40:25:35) se separaron los extractos de diclometano y etanol y en la fase móvil n-butanol:ácido acético glacial:agua (50:10:40) se desarrollaron los extractos etanólicos y acuosos; la placa se analizó utilizando luz ultravioleta a 254 y 365 nm.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
Análisis micrográfico
La micrografía constituye una técnica sencilla que permite identificar una especie vegetal y su grado de pureza, mediante la comparación de su morfología con una muestra autentica. Esta técnica constituye una herramienta básica y valiosa cuando se trata de muestras pulverizadas de droga. El análisis micrográfico de Urtica urens se realizó comparando su morfología con otra reportada en un estudio anterior (Boelcke y Viznis, 1987), donde U. urens presenta numerosos tricomas o pelos como una de sus características más notables, estos pelos urticantes son pelos glandulares que en su ápice presentan una zona de fácil ruptura al contacto. La aclaración leve con hidrato de cloral de una muestra de la planta recolectada evidenció (figura 1) la presencia de pelos urticantes unicelulares y pluricelulares, parénquima y vasos helicoidales
a) pelo urticante unicelular (400 x). b) pelo pluricelular (400x).c) parenquima (400x). d) vaso helicoidal (400x).
Análisis de las características organolépticas de las plantas recolectadas
Las características organolépticas de la droga seca, indican el estado de conservación de la misma, si una droga seca perdiese su color u obtuviese un olor extraño, se consideraría que fue procesada de forma inadecuada. De acuerdo con las características determinadas (tabla 2), el material vegetal estaría en buenas condiciones para su conservación.
Caraterística | Urtica urens L. |
olor | Sui generis |
color | Verde oscuro |
sabor | Propio |
condición | Parte aérea seca |
textura | Urticante |
Determinación del contenido de humedad
Una manera de conservar la droga cruda es eliminar el exceso de humedad y así evitar el crecimiento de bacterias u hongos, también se evita la transformación de sus constituyentes químicos por hidrólisis. Las monografías de las farmacopeas limitan el contenido de agua en drogas vegetales entre 8 y 14%. El porcentaje de humedad determinado por el método directo para la especie vegetal U. urens L. fue de 2,59% (tabla 3). Este valor, por ser menor a 10%, se encontraría dentro del rango establecido en farmacopeas para garantizar su estabilidad vegetal (British Pharmacopoea, 2004; Sharapin, 2000).
Determinación de cenizas totales
La cantidad de ceniza que se obtiene es un indicativo de la calidad de la muestra y constituye una base para evaluar su pureza, brinda información acerca de una posible adulteración con material inorgánico o cuerpos extraños y de su contenido en sales inorgánicas. Las cenizas totales se componen generalmente de fosfatos, carbonatos, sulfatos, sílice y silicatos. El porcentaje de cenizas totales para U. urens L. fue de 24,78% (tabla 3), el valor de referencia es 8%.
Determinación de cenizas ácidas
Las cenizas insolubles en ácido se componen de sílice, un elevado porcentaje de estas cenizas indica contaminación con productos térreos, el valor de estas cenizas puede alertar sobre la presencia de metales pesados en la composición de la planta. La determinación del porcentaje de cenizas ácidas para U. urens L. fue 2,23% (tabla 3). U. urens L. presentó un mayor contenido de carbonatos (solubles en HCl).
Determinación de cenizas solubles en agua
La determinación de este parámetro dio 6,34%, (tabla 3). Este valor experimental confirmaría que la muestra de U. urens L. contiene mayor cantidad de carbonatos (insolubles).
Determinación de elementos extraños
La dificultad de obtener una droga vegetal enteramente pura es totalmente reconocida, las farmacopeas contienen estamentos para el porcentaje de otras partes de la planta o de la materia orgánica que puede ser permitida en la droga que será usada con fines medicinales. En general, las drogas contienen una apreciable cantidad de materia extraña, excrementos de animales, insectos, hongos, etc. Sin embargo el porcentaje de tales sustancias puede ser insuficiente para causar el rechazo de la droga.
La determinación del porcentaje de elementos extraños en U. urens L. es 0,5%, (tabla 3). no cuentan con datos específicos para su contrastación con el valor obtenido. Sin embargo, de manera general, las farmacopeas establecen como valor límite de materia extraña del 2%.
Determinación del índice de hinchamiento
El índice de hinchamiento de una muestra vegetal, es el volumen, expresado en mililitros (ml), ocupado por un gramo de droga cuando ésta es humedecida. El índice de hinchamiento determinado para U. urens fue de 17 ml (tabla 3). Este valor indica que U. urens L. posee una mayor capacidad para retener agua.
Humedad (%) | 2,59 |
Cenizas totales (%) | 24,78 |
Cenizas ácidas (%) | 2,23 |
Cenizas solubles (%) | 6,34 |
Elementos extraños (%) | 0,5 |
Índice de hinchamiento (ml) | 17 |
Rendimiento de los procesos de extracción
En la tabla 4, se presenta el rendimiento de los extractos obtenidos con disolventes de polaridad creciente, estos rendimientos se tendrán en cuenta al momento de calcular la dosis de administración de cada extracto requerida en ensayos farmacológicos.
Especie | Medio de Extracción | Rendimiento de la extracción (%) |
Urtica urens L. | Etéreo Diclorometánico Etanólico Acuoso | 3,5 1,3 2,7 13 |
La tasa de extracción de U. urens L. fue mayor cuando se utilizó un medio acuoso, lo que le otorga a los componentes químicos de esta planta una mayor capacidad de disolución.
Determinación de la composición cualitativa de grupos mayoritarios de moléculas en los extractos de Urtica urens L. mediante la técnica screening fitoquímico.
La caracterización de los grupos químicos activos de esta especie vegetal se recoge en la tabla 5.
Ensayo | Extracto Etéreo | Extracto Diclorometánico | Extracto Etanólico | Extracto Acuoso |
Taninos | - | + | +++ | +++ |
Alcaloides | + | + | ++ | + |
Compuestos reductores | - | + | ++ | +++ |
Esteroles | + | - | +++ | +++ |
Flavonoides | - | - | - | +++ |
Polisacáridos | - | - | - | ++ |
Mucílagos | - | - | - | +++ |
Saponinas | - | - | - | - |
Amidas | - | - | - | - |
Antocianidinas | - | - | - | + |
Cumarinas | - | - | + | + |
(+) Prueba positiva, (-) Prueba negativa
De acuerdo con los datos recogidos en la tabla 5, la muestra de U. urens L. presenta taninos en los extractos diclorometánico, etanólico y acuoso; alcaloides en los extractos diclorometánico, etanólico y acuoso; compuestos reductores en los extractos etanólico y acuoso; flavonoides en el extracto acuoso; esteroles en los extractos acuoso y etanólico; polisacáridos en el extracto acuoso, mucílagos en el extracto acuoso; antocianidinas en el extracto acuoso y cumarinas en los extractos etanólico y acuoso.
En los extractos acuoso y etanólico se ha obtenido un resultado fuertemente positivo para la presencia de flavonoides que coincide con los resultados obtenidos en anteriores estudios (Marrasini y col, 2010; Florence y col., 2010).
Perfil cromatográfico de los extractos
Mediante el perfil cromatográfico se pudo observar la separación gradual de los componentes de los extractos en bandas, en orden creciente de interacción con la fase estacionaria.
Extracto etéreo
En el revelado de las placas cromatográficas del extracto etéreo de U. urens L. se observan bandas azuladas a 365 nm, (figura 2), lo que indicaría la presencia de alcaloides, esteroles. Por otra parte, las manchas amarillas sugiere la presencia de grasa.
Fase móvil: a) y b) tolueno/acetona (9:2); a) Rf=0,83 b) Rf=0,70 (365 nm).c) y d) Éter/acetona (9:1); a) Rf=0,80 d) Rf1=0,13; Rf2=0,22; Rf3=0,37 (365nm)
Extracto diclorometánico
En el revelado de las placas cromatográficas del extracto diclorometánico de U. urens L. se observan bandas amarillas, amarillo verdosas y azules fluorescentes relacionadas con la presencia de estructuras tipo flavonoide, alcaloides, las bandas de color rojo indicarían la presencia de clorofila (figura 3).
Fase móvil: a) y b) tolueno/acetona (8:2); a) Rf1=0,08; Rf2=0,12; Rf3=0,26; Rf4=0,55; Rf5=0,74; Rf6=0.79; Rf7=0,84; Rf8=0,87; Rf9=0,94; c) Rf=0,61 (365 nm). c), d) y e) Éter/acetona (9:1); c) Rf1=0,02; Rf2=0,05; Rf3=0,07; Rf4=0,08; Rf5=0,12; Rf6=0.8 d) Rf1=0,27 (365nm) e) Rf1=0,35; Rf2=0,74 (254 nm). f) tolueno/cloroformo/acetona (40:25:35) Rf1=0,55; Rf2=0,62; Rf3=0,74; Rf4=0,80
Extracto etanólico
En el revelado de las placas cromatográficas del extracto etanólico de U. urens L. se observan bandas amarillas verdosas y azules fluorescentes a 365 nm que pudieran estar relacionadas con estructuras tipo esteroidal, alcaloides (figura 4).
Extractos acuosos
Finalmente, los extractos acuosos, aunque mostraron evidencias cualitativas propias de flavonoides, los compuestos presentes en estas fracciones resultaron muy retenidos y poco resueltos en las fases móviles evaluadas (figura 5).
Fase móvil: c) y d) n-butanol/ácido acético/agua (50:10:40); c) Rf1=0,64; Rf2=0,69 (365 nm) d) Rf1=0,2; Rf2=0,30 (254 nm)
La repetitividad en las distancias entre las bandas de las distintas cromatoplacas confirmaría de alguna manera la presencia de flavonoides.
Conclusiones
Siguiendo la metodología establecida en la Real Farmacopea Española, para la especie vegetal, se ha determinado en Urtica urens L. los elementos celulares y no celulares que la caracterizan, los parámetros de calidad determinados fueron humedad 2,59%, cenizas totales 24,78% este valor según la Agencia Europea del medicamento no debiera ser mayor al 8%, pero en esta especie se reporta que sus hojas son ricas en potasio y sílice, lo que puede explicar su alto contenido en cenizas Las .cenizas ácidas 2,23%, cenizas solubles en agua 6,34%, elementos extraños 0,5%, índice de hinchamiento 17ml encontrándose dentro de los valores establecidos. El screening fitoquímico realizado a los extractos etéreo, diclorometánico, etanólico y acuoso de U. urens L. reveló una importante presencia de flavonoides, esteroles, taninos, alcaloides y compuestos reductores en ambas especies vegetales, este screening realizado de manera preliminar nos permite aproximarnos a conocer la composición de esta especie que crece en la provincia Ingavi. Se elaboró el perfil cromatográfico para los extractos etéreo, diclorometánico, etanólico y acuoso de U. urens. Los resultados obtenidos no son concluyentes ya que pueden cambiar según la época y lugar de recolección.