Artículo Original

   Patrones diferenciales entre Leishmaniasis y chagas, empleando epimastigotes de Trypanosoma cruzi

 

Differential patterns between leishmaniasis and chagas disease using Trypanosoma cruzi epimastigotes

 

 

 N. Marisol Córdova R.¹, Jhoana Zurita T.², Miguel Guzmán-R.¹, Aleida Verduguez-O.¹, Ernesto Rojas C.¹

 

 ¹CUMETROP- IIBISMED, Facultad de Medicina, Universidad Mayor de San Simón. https://orcid.org/0000-0002-4406-8053, https://orcid.org/0000-0001-9753-5885, https://orcid.org/0000-0001-7896-9952, https://orcid.org/0000-0002-8959-9624. ²Bioquímica,  Facultad de Medicina, Universidad Mayor de San Simón. https://orcid.org/0000-0002-2156-1208 .  *Correspondencia a: N. Marisol Córdova R. Correo electrónico: nmarcordova@yahoo.com

Recibido el 10  de julio de 2020.

Aceptado el 01 de octubre de 2020.

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Resumen

En diferentes  regiones de Latinoamérica  la infección por T. cruzi  y Leishmania  se superponen, por lo cual se reportan infecciones mixtas circulantes, debido a esto; deben realizarse   pruebas diagnósticas específicas   para evitar  reacciones cruzadas entre estas dos patologías.

Objetivo: determinar patrones de fluorescencia que permitan la diferenciación entre Leishmaniasis, enfermedad de Chagas e infección mixta empleando epimastigotes de T. cruzi. 

Métodos: se empleó la técnica de Inmunofluorescencia Indirecta utilizando epimastigotes de T. cruzi (TcV autóctono) como antígeno figurado frente a un  panel de muestras de suero  codificados como A, B, C y D correspondientes a pacientes con infección por: Leishmaniasis  (A),  Infección mixta por Leishmania y Chagas(B),  Enfermedad de Chagas (C) y sin ninguna de las dos infecciones (D).

Resultados: en  los cuatro paneles de muestras se observaron diferentes patrones de intensidad de fluorescencia a nivel de membrana y núcleo de los epimastigotes de T. cruzi (TcV autóctono).

Conclusiones: la técnica de Inmunofluorescencia (IFI) con antígenos  de epimastigotes de  T. cruzi  a demostrado utilidad en la diferenciación entre enfermedad de Chagas, Leishmaniasis y/o   infecciones mixtas por ambos parásitos en aquellas zonas donde la coexistencia de ambas es habitual 

Palabras clave: leishmaniasis, chagas, Trypanosoma cruzi, epimastigotes, Técnica del Anticuerpo Fluorescente Indirecta.

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Abstract

In different regions of Latin America, infection by T. cruzi and Leishmania overlap, for which mixed circulating infections are reported, due to this; Specific diagnostic tests must be performed to avoid cross reactions between these two pathologies.

Objective: to determine fluorescence patterns that allow the differentiation between Leishmaniasis, Chagas disease and mixed infection using T. cruzi epimastigotes.

Methods: the Indirect Immunofluorescence technique was used using epimastigotes of T. cruzi (autochthonous TcV) as figurative antigen against a panel of serum samples coded as A, B, C and D corresponding to patients with infection by: Leishmaniasis (A) , Mixed infection by

Leishmania and Chagas (B), Chagas disease (C) and without either of the two infections (D).

Results: in the four sample panels, different patterns of fluorescence intensity were observed at the membrane and nucleus level of the epimastigotes of T. cruzi (autochthonous TcV).

Conclusions: the Immunofluorescence technique (IFI) with T. cruzi epimastigote antigens has proven useful in differentiating between Chagas disease, Leishmaniasis and / or mixed infections by both parasites in areas where the coexistence of both is common.

Keywords:  leishmaniasis, chagas, Trypanosoma cruzi, epimastigotes, Fluorescent Antibody Technique Indirect.

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La enfermedad   de Chagas, también llamada Tripanosomiasis Americana, es una enfermedad  causada por el parásito protozoo Trypanosoma cruzi¹. La Organización Mundial de la Salud (OMS), estima que    existe entre 6 y 7 millones de personas infectadas por Trypanosoma cruzi causante de  la enfermedad de Chagas, en 21 países  del  continente americano; por lo que  aproximadamente el 13% de la población Latinoamericana, estaría en riesgo de contraer la enfermedad². Bolivia, dentro este contexto  sufre  una de las tasas de infección más altas de casos de enfermedad de Chagas con una seroprevalencia superior al 50%³. Esta enfermedad, estaba establecida casi exclusivamente en áreas rurales. Actualmente   las migraciones poblacionales,  no solo desde zonas rurales sino también los movimientos poblacionales a través de los diferentes continentes,   hacen que sobrevenga un cambio en el perfil  epidemiológico de la enfermedad de Chagas^4-6.

La Organización Mundial de la Salud respecto a la Leishmaniasis indica, que hay cerca de 1 500 000 personas afectadas por las diversas formas de Leishmaniasis en todo el mundo. Se considera que, alrededor de 350 millones de personas están en riesgo de infectarse y enfermarse cada año^7-9. En Bolivia la Leishmaniasis  es menos frecuente que la enfermedad de Chagas, sin embargo, esta enfermedad afecta a personas en cinco de los nueve departamentos que tiene  Bolivia¹⁰.

En diferentes regiones de Latinoamérica  la infección por T.cruzi y Leishmania, se superponen^10-12. Es el caso de algunas regiones del Brasil, los Yungas en  Bolivia y  el norte Argentino,  en las cuales  se sobreponen  ambas infecciones^10,14.  Reportes previos, indican  la existencia de infecciones mixtas circulantes, tanto  en reservorios como en humanos,  con presencia de nichos ecológicos sobrepuestos  de T.cruzi y Leishmanias^12,13, ocasionando el desarrollo de infecciones mixtas, razón por la cual se debe aplicar con prudencia pruebas diagnósticas  convencionales ya  que pueden  presentar  reacciones cruzadas¹⁴. De ahí la importancia de realizar diferentes pruebas serológicas como ELISA, HAI e IFI específicas para el diagnóstico de la fase crónica de la enfermedad de Chagas y el frotis y/o cultivo para el diagnóstico de Leishmaniasis tegumentaria americana¹⁵.

Usualmente, para el diagnóstico serológico de la Leishmaniasis y la enfermedad de Chagas, se empleaba la Inmunofluorescencia Indirecta (IFI).  Técnica de costo   relativamente bajo debido a que el sustrato antigénico puede ser preparado en cualquier laboratorio de mediana complejidad¹⁶, además, dicha técnica es   de muy buena sensibilidad y especificidad diagnóstica, especialmente para la enfermedad de Chagas¹⁷. Sin embargo, actualmente el empleo  de esta técnica  serológica para el diagnóstico de la Leishmaniasis queda en duda, ya que expertos no   recomiendan el uso de  del IFI  cuando  la enfermedad de Chagas y Leishmaniasis coexisten^15,18, especialmente en las regiones tropicales  y subtropicales   por las posibles reacciones  cruzadas  entre ambas patologías a títulos bajos, debido  a que los agentes etiológicos de estas  dos enfermedades poseen una ascendencia común muy cercana^19,20, por lo  tanto,  es de esperar que compartan una significativa cantidad de características antigénicas. Por ello, pacientes con alguna de las dos infecciones o con infección mixta pueden resultar mal diagnosticadas, debido a   reacciones serológicas cruzadas cuando se usan mezclas de antígenos no caracterizados^21,22.

Ante la necesidad de diferenciar entre estas dos patologías en una región  tropical del departamento de Cochabamba, donde cohabitan   ambas patologías, debido a los  flujos migratorios poblacionales durante los últimos años, desde zonas endémicas      para Chagas a     regiones          tropicales  endémicas para Leishmaniasis,  se realiza este estudio descriptivo,  con el fin de determinar el diagnóstico diferencial de la Leishmaniasis,  enfermedad de Chagas  e Infección mixta empleando epimastigotes de T. cruzi (TcV autóctono )    siguiendo la técnica de Luis Vásquez Huerta y col.¹⁶.

Material y métodos

Se estudiaron 97 muestras de  sueros sanguíneos  pertenecientes a personas con ausencia de  infección por Chagas y/o Leishmaniasis y personas  infectadas por T. cruzi  y Leishmania spp, dispuestos de la siguiente manera:  Muestras  de suero de pacientes  con  Infección por Leishmania spp (n=23), Muestras de suero de  pacientes  con Infección mixta por Leishmania spp y T. cruzi (n=11), Muestras  con Infección por T. cruzi (n= 30)  y Muestras de suero de  pacientes sin evidencias de ambas infecciones (n= 33). Dichos paneles, fueron preparados a partir de muestras   recolectadas en el laboratorio de inmunología del servicio LABIMED y el laboratorio del hospital San Francisco de Asís del municipio de Villa Tunari.

Los paneles de sueros fueron organizados en cuatro grupos (A, B, C, D), resumidas en la tabla 1, haciendo un total de 97 muestras obtenidas.

Procedimientos analíticos:

a. Obtención de epimastigotes de T. cruzi

Los parásitos de Trypanosoma cruzi (TcV) en su forma de epimastigotes  fueron donados por la Dra. MC Torrico, los cuales fueron  obtenidos a partir de cultivos en el laboratorio de Parasitología del servicio LABIMED, Facultad de Medicina, Universidad Mayor de San Simón.

b. Inmunofluorescencia Indirecta (IFI)

Para la técnica de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI),  se empleó un control positivo y control negativo.   Como antígeno  se utilizó epimastigotes de Trypanosomas obtenidos de  cultivos (Donación), los cuales fueron  fijados en láminas y conservados en el congelador.  Sobre éstas láminas, se realizó la reacción antígeno-anticuerpo.

En una placa de microtitulación se realizó las diluciones 1/16, 1/32 y 1/64 de cada suero a evaluar y de los controles.  Estos una vez homogenizados se dispensaron en el área del círculo correspondiente a la lámina. Una vez incubada la placa, realizado el lavado con PBS-Tween y posterior secado, se agregó 15 uL del conjugado Anti IgG humano marcado con fluoresceína (Biomerieux), se incubó por 30 minutos, se volvió a lavar las láminas y se las dejó secar para realizar las lecturas.

c. Observación por microscopia de inmunofluorescencia 

Durante la   observación de las  muestras,   se puso  énfasis  en la intensidad, presencia y ausencia de fluorescencia en la  superficie y núcleo de los epimastigotes.

Las lecturas se registraron como: Positivo para Chagas(+). Cuando la superficie o los bordes de los parásitos fluorescieron   de un color verde manzana intenso.  Positivo para Leishmania. Se registró, cuando el núcleo de los parásitos fluorescieron  de un color verde manzana intenso, de acuerdo con la ref¹⁶.

Mixto  Cuando la superficie y el núcleo fluorescieron  de color verde intenso y Negativo (-) Si los parásitos se observan opacos y oscuros Indeterminado (I) Si se observa una débil fluorescencia no homogénea  ya sea en la superficie o núcleo de los parásitos.

d. Técnica de HAI para Chagas

Para la Hemaglutinación Indirecta se empleó el kit HAI Chagas Polychaco  que emplea glóbulos rojos de carnero. La dilución con la que se inició el procedimiento fue 1/8, para lo cual en una  placa de microtitulación,  se  colocó a  los primeros pocillos 70 μL del diluyente de sueros y 25 μL de diluyente a los segundos, terceros y cuartos pocillos.  A los primeros pocillos,  se colocó también  10 μL  de los sueros a evaluar,  además los sueros control positivo y negativo. Se realizó diluciones sucesivas transfiriendo 25 uL de los sueros a evaluar, desde la dilución 1/8 hasta el 1/64, desechando los últimos 25uL. Posteriormente se agregó 25uL de la suspensión antigénica a cada pocillo. Se agitó y se dejó en reposo la placa por 60 minutos hasta realizar las lecturas.

Análisis estadístico

El análisis estadístico de los resultados se realizó mediante Distribuciones de Frecuencias.

Consideraciones éticas

Se obtuvo la autorización de los pacientes para la obtención de muestras de sangre para fines de este estudio, en ambos laboratorios.

Resultados

Los paneles de suero sanguíneos (Tabla 1), representan a sujetos con características diagnosticas definidas. 

Las muestras incluidas en el panel A, correspondientes a 23 personas, se identificaron como infección por Leishmania spp en base a los resultados de diagnóstico clínico y por laboratorio. Las muestras del panel B, pertenecían a 11 personas que presentaban infección mixta por Leishmania spp y T. cruzi, según los resultados de laboratorio de diagnóstico realizados. Así mismo las muestras incluidas en el panel C correspondían a 30 personas con infección por Trypanozoma cruzi. Finalmente, las muestras del panel D pertenecían a 33 personas sin evidencias  de ninguna de las infecciones indicadas.

Tabla 1. Características de los paneles de suero sanguíneo según los exámenes de laboratorio realizados

 

 

La observación microscópica de la reacción entre los epimastigotes de T. cruzi empleados como antígeno figurado para la técnica de microscopia de inmunofluorescencia con las muestras de suero del Panel “A”, correspondientes a personas con infección por Leishmania spp (Figura 1 y Tabla 2), evidencia la presencia de un patrón de fluorescencia nuclear exclusivamente que se visualiza como fluorescencia interna que se irradia hacia la periferia.

 

Figura 1. Patrón de fluorescencia de núcleo otorgan a los epimastigotes de T. cruzi empleados como antígeno figurado, una intensidad de fluorescencia marcada que se aprecian como pequeñas bombillas con iluminación de color verde fluorescente central e irradiación hacia la periferia.  El patrón de fluorescencia nuclear corresponde a muestras de personas identificadas como infección por Leishmania spp (panel A).

Tabla 2. Muestras de sueros según el patrón de fluorescencia que producen con epimastigotes de Trypanosoma cruzi.

Datos expresados en frecuencia (%).

 

El panel “B” correspondientes a individuos identificados con infección mixta por   Leishmania spp y T. cruzi, en la observación por microscopia de fluorescencia, presentaron un patrón de fluorescencia nuclear y de membrana con diferente grado de intensidad (Figura 2 y Tabla 2).   

Figura 2. Patrón de fluorescencia de núcleo y membrana otorgan a los epimastigotes de T. cruzi empleados  como antígeno figurado, una intensidad de fluorescencia marcada que se aprecian como pequeñas bombillas con iluminación de color verde fluorescente.  El patrón de fluorescencia núcleo/membrana corresponde a muestras de personas identificadas como coinfección por Leishmania spp y Trypanosoma cruzi.  (Panel B).      

El comportamiento de las muestras del panel “C”, proveniente de individuos identificados como infección por T. cruzi, presentaron un patrón de fluorescencia de membrana exclusivamente con intensidad de tres cruces mayoritariamente (Figura 3 y Tabla 2).

 

 

Figura 3. Patrón   fluorescencia de  membrana otorgan a los epimastigotes de T. cruzi   empleados como antígeno figurado, una intensidad de fluorescencia periférica que define el contorno de los parásitos. El patrón de fluorescencia de membrana corresponde a muestras de personas identificadas como infección por  Trypanosoma cruzi. (Panel C)    

Del panel “D”, un 24% de las muestras presentaron fluorescencia nuclear, los cuales  corresponden a  individuos sin ninguna de las dos infecciones estudiadas y con residencia permanente en el área tropical. (Tabla 2).

Al análisis de las muestras que no presentaban ninguna evidencia de infecciones por T cruzi ni Leishmania spp , agrupadas según correspondía a  personas residentes en el  área tropical (AT) o área periurbana de la ciudad de Cochabamba (AP),  reflejaron ausencia  de fluorescencia a nivel de membrana (M0) y de núcleo (N0) en el 38% de las muestras  del AT  y en el 100% de las muestras AP. La presencia de fluorescencia    nuclear con intensidad una cruz (N1) se observó en el  62% de las muestras AT (Figura 4).

 

Figura 4. Frecuencia de muestras de suero según el patrón de fluorescencia que producen en la reacción de anticuerpos marcados con fluorocromos que reaccionan con epimastigotes de Trypanosoma cruzi, de personas sin evidencias de ninguna de las infecciones evaluadas (Leishmania spp y T. cruzi). AT= Panel de muestras de suero de personas residentes en área tropical (n= 13); AP= Panel de muestras de suero de personas residentes en el área periurbana de la ciudad de Cochabamba (n=20).     

Discusión

La Leishmaniasis y enfermedad de Chagas tienen una amplia distribución, tanto en las áreas rurales y tropicales del Continente latinoamericano. Ambas son consideradas por la OMS como   enfermedades tropicales de gran  importancia, dentro las  “Enfermedades Olvidadas o desatendidas”²³. Estas dos enfermedades son transmitidas por diferentes especies de protozoarios del orden kinetoplástida^24,25.  Estos  tripanosomátidos  presentan un único flagelo   que sobresale de un bolsillo anterior o bien está insertado lateralmente y adherido a la célula a lo largo de toda su longitud, características que los hacen muy similares^22,25.

Bolivia se ha caracterizado principalmente, por los altos índices de Leishmaniasis mucocutánea (MCL,) y Leishmaniasis cutánea (LC)⁴.  El incremento de los casos de leishmaniasis en estos últimos años, se atribuyen principalmente a los nuevos asentamientos humanos debido a la migración poblacional, mayoritariamente de zonas endémicas para la enfermedad de Chagas hacia las regiones tropicales^5,6, lo cual produce cambios en la conducta de la enfermedad, debido a la coexistencia de ambas enfermedades; es el caso  de  la región tropical de Cochabamba. De ahí  la importancia de detectar ambas patologías en estas regiones donde ambas enfermedades  cohabitan, por la  repercusión negativa que se podría tener, en  el inicio del tratamiento de la Leishmaniasis con Antimoniato de N- metilglumina (Glucantime®), ya  que  uno de los  efectos adversos de este medicamento de primera línea es la   cardiotoxicidad²⁶.

El diagnóstico inmunológico de Leishmaniasis y Chagas, presenta problemas respecto a las reacciones cruzadas con diferentes especies de  Leishmania spp y Trypanosoma rangeli^10,12,27 especialmente en aquellas zonas coendémicas, es por esto que  los ensayos convencionales por Inmunofluorescencia suelen tropezar  con esta dificultad, debido al tipo de antígeno empleado al momento de detectar anticuerpos anti-T.cruzi en personas  que presentan coinfección por ambos tripanozomatidos^10,11,27,28. En este estudio, para poder determinar el diagnóstico diferencial entre Leishmaniasis y Chagas se empleó como antígeno epimastigotes T. cruzi¹⁴, y como se muestra en las Figuras 1 y 2 se observó la existencia del patrón de fluorescencia nuclear con los sueros   que corresponden a personas con leishmaniasis (panel A) mientras que para las infecciones mixtas se observó  un patrón de fluorescencia nuclear y periférico (panel B), por otro lado, se aprecia un patrón periférico es decir fluorescencia a nivel de membrana con los sueros que corresponden a personas diagnosticadas con enfermedad de Chagas (panel C) (Figura 3) lo cual concuerda con los resultados de un estudio previo^14,29,30.

Por otra parte, al realizar  la identificación de las muestras provenientes de área tropical (AT) o del área periurbana de Cochabamba (AP) sin evidencia de ninguna de las dos afecciones (panel D), se evidenció la presencia de fluorescencia nuclear con intensidad de una cruz (N1) en 8/13 (62%) de las muestras provenientes de individuos residentes en el área tropical (Figura 4), aspecto que no se observa en las muestras de sueros de los residentes en el área periurbana. La presencia de fluorescencia en este grupo de población  del trópico podría deberse  a  que  el sistema  inmune de los individuos residentes del área tropical, promovieron la eliminación directa como indirecta, por fagocitosis  del microorganismo agresor, desarrollando  posteriormente anticuerpos de memoria que fueron  detectados  a través de la Inmunofluorescencia,  esta sería una de las razones para que  dichos individuos no presentasen  lesiones clínicas visibles. Por lo tanto, factores como la especie y la virulencia de la Leishmania junto con la respuesta inmune y nutricional del hospedero podrían ser responsable de estos resultados³¹.

La técnica de Inmunofluorescencia (IFI) con antígenos  de epimastigotes de  T. cruzi  a demostrado utilidad en la diferenciación entre enfermedad de Chagas, Leishmaniasis y/o   infecciones mixtas por ambos parásitos en aquellas zonas tropicales donde la coexistencia de ambas es habitual, debido a la migración de personas   desde zonas endémicas para Chagas.  Por lo tanto, esta técnica; poniendo énfasis en la   observación microscópica de los patrones de inmunofluorescencia   podría ser interesante además de  viable  desde el punto de vista técnico y económico  como una alternativa dentro las pruebas convencionales.

Agradecimientos

A la Dra. MC Torrico y al Lic. Amilcar Flores por su colaboración para el desarrollo del presente trabajo.

Conflicto de intereses: los autores declaran que no existe conflicto de intereses.

Referencias bibliográficas

1.- Perez-Molina JA, Molina I. Chagas disease. Lancet. 2018; 391:82–94.         [ Links ] doi.:0.1016/S0140-6736(17)31612-4.

2.- World Health Organization. Global health estimates 2016 summary tables: DALYs by cause, age and sex, by WHO region, 2000 –2016. World Health Organization, Geneva, Switzerland. 2018. https://www.who.int/healthinfo/global_burden_disease/estimates/en/index1.html.

consultado: enero 2020.

3.- Yager JE ,  Lozano Beltran DF , Torrico F ,  Gilman H ,  Bern C. Prevalence of Chagas heart disease in a region endemic for Trypanosoma cruzi: evidence from a central Bolivian community. Glob Heart. 2015; 10(3):145-50.         [ Links ]  doi: 10.1016/j.gheart.2015.07.002.

4.- Briceño-León R. La enfermedad de Chagas en las Américas: una perspectiva de ecosalud. Cad Saúde Pública. 2009; 25 (1): S71-82.         [ Links ]

5.- Albarracin-Veizaga H, Carvalho ME , Nas-cimento EMM, Rodrigues VLCC, Casanova C, Barata JMS. Chagas disease in an area of recent occupation in Cochabamba, Bolivia . Rev Saúde Pública. 1999; 33(3): 230          [ Links ]  

6.- Aguilar HM, Abad-Franch F, Pinto-Diaz JC, Veríssimo-Junqueira AC, Rodriguez-Coura J. Chagas disease in the amazons region; Mem. Inst Oswaldo Cruz 2007; 102 (Suppl 1): 31.       

7.- Maita Garcia X.,  Miranda Gutiérrez C.,  Marañon Mendoza L.C., Carvajal Yañez  N., Santander López A., Características Epidemiológicas de la Leishmaniasis en el Departamento de Cochabamba Durante el Periodo 2002-2010. Rev Cient Cienc Méd. 2011: 14 (2);.

8.- Pérez León J.L., Kindelán Mercerón F.M., García QuintanaY. Jorge Felix Prat Ricardo J.F., Leishmaniosis Cutánea en un Adulto Mayor. MEDISAN Vol.19 no.9 Santiago de Cuba set.-set. 2015.

9.- Sánchez-Saldaña L., Sáenz-Anduaga E.,Pancorbo-Mendoza J., Zegarra-Del-CarpioR., Garcés-Velasco N., Regis-Roggero A. Leishmaniasis .Dermatología Peruana 2004; vol 14: No 2-82

10.- Bastrenta B., Mita N.,  Buitrago R., F Vargas F., Flores M.,M Machane M., Yacsik N.,  Torrez M., Le Pont F., Brenière F. Infecciones humanas mixtas de Leishmania spp. y Leishmani a- Trypanosoma cruzi en un área subandina boliviana: identificación por reacción en cadena de la polimerasa / hibridación e isoenzima. Mem. Inst. Oswaldo Cruz vol.98 no.2 Río de Janeiro marzo de 2003.

11.- Gil J., Cimino, Ines R., lopez Quiroga I., Cajal S., Acosta N., Juarez M.,  Zacca R., Orellana V.,  krolewiecki A., Diosque P., Nasser J. Reactividad Del Antigeno GST-SAPA De Trypanosoma cruzi Frente a Sueros De Pacientes Con Enfermedad De Chagas y Leishmaniasis. MEDICINA (Buenos Aires) 2011; 71: 113-119         [ Links ]

12.-Passos VMA, Volpini AC, Braga EM, PAF Lacerda PAF, Ouaissi A, Lima-Martins MV, Krettli AU. Serodiagnóstico diferencial de infecciones humanas causadas por Trypanosoma cruzi y Leishmania spp. Uso de ELISA con un antígeno recombinante (rTc24). Mem. Inst. Oswaldo Cruz Vol. 92 (6): 791-793. Dec. 1997.

13.-Delmans F. M Ch.,  Postigo J. , Mita Mendoza N.,  Cruz I., Alvar Ezquerra J.,  B. Bastrenta. Leishmaniasis visceral subclínica en 123 individuos de un cantón de la provincia Caranavi-La Paz Rev. Soc. Bol. Ped. 2002; 41 (2): 61-66.         [ Links ]

14.- Frank FM, Fernández MM, Taranto NJ, Cajal SP, Margani RA, Castro E, Thomaz-Soccol V,  Malchiodi EL. Characterization of human infection by Leishmania spp. in the Northwest of Argentina: immune response, double infection with Trypanosoma cruzi and species of Leishmania involved. Parasitol. 2003; 126(1), 31–39.         [ Links ] doi.: 10.1017/S0031182002002585

15.- Romero Peñuela M.H., Sánchez Valencia J.A. Uso de Antígenos Recombinantes para la Evaluación Serológica de Leishmaniasis Visceral y Tripanosomiasis Canina. Biosalud, Volumen 8, enero - diciembre, 2009. págs. 77 – 83.

16.- Vásquez HuertaL., Ruelas Llerena N.,Córdova Benzaquen E. Patrones de coloración en la inmunofluorescencia indirecta y su utilidad en el diagnóstico de leishmaniasis tegumentaria y enfermedad de Chagas Acta méd. peruana v.28 n.1 Lima ene./mar. 2011.

17.- Gomes Y. M. PCR y serodiagnóstico en la enfermedad de Chagas crónica: avances biotecnológicos. Apl Biochem Biotechnol.1997; 66 (1):107- 119.         [ Links ]

18.- Caballero ZC, Sousa OE, Marques WP, Saez-Alquezar A, Umezawa ES. Evaluation of serologi-cal tests to identify Trypanosoma cruzi infection in humans and determine cross-reactivity with Trypanosoma rangeli and Leishmania spp. Clin Vaccine Immunol 2007; 14(8): 1045-9.         [ Links ]    

19.-Wendel S, Gonzaga A. La enfermedad de Chagas y la transfusión de sangre: ¿un problema del nuevo universo? Vox Sang. 1993; 64 : 1–12.         [ Links ]

20.-Escalante H, Jara C, Davelois K, Iglesias M, Benites A, Espinoza E. Estandarización de la técnica de Western Blot para el diagnóstico específico de la enfermedad de Chagas utilizando antígenos de excreción-secreción de los epimastigotes de Trypanosoma cruzi. Rev Peru Med Exp Salud Pública. 2014;31(4):644-51.         [ Links ]

21.- Requena JM, Soto A. Evolutionarily Conserved Proteins as Prominent Immunogens during Leishmania Infections. Parasitology Today 2000;16(6):246-250.         [ Links ]

22.-Levin M, Mesri E, Benarous R, Levitos G, Schijman A, Leyati P, Chiale P, Ruiz A M, Khan A, Rosenbaum M, Torres HN, Segura EL. Identificación de los principales determinantes antigénicos de Trypanosoma cruzi en la enfermedad de Chagas crónica. Am J Trop Med Hyg. 1989; 41  530 538.         [ Links ]

23.-World Health Organization. The 17 neglected tropical diseases. Geneva: WHO; 2014,         [ Links ] disponible en: http://www.who.int/neglected_diseases/diseases/en/ (consultado 15 de febrero de 2020)

24.- Lake J A, De La Cruz V F, Ferreira P G, et al. Evolution of parasitism: Kinetoplastid protozoan history reconstucted from mitochondrial rRNA gene sequences. Proc Natl Acad Sci 1988; 85: 4779-83         [ Links ]

25.-Vargas-Parada, L.  (2010)  Kinetoplastids and Their Networks of Interlocked DNA. Educación de la naturaleza  3 ( 9 ) : 63.

26.- Felipe Silva de Freitas P., Rodrigues Borges R.,Hiroshi Sakamoto L.B.,Naves Gonçalves M.,  Marilene da Silva A., Dutra de Moura F.J., Ribeiro SampaioR.N.,  Joel Paulo Russomano VeigaJ.P. AVALIAÇÃO DO ELETROCARDIOGRAMA DE PACIENTES COM LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA TRATADOS COM ANTIMONIAL PENTAVALENTE (GLUCANTIME®) Rev Patol Trop Vol. 43 (4): 405-411, 2014.

27.-Ana de Cássia Vexenat A.,SantanaJ.M., Teixeira A.R.L. Cross-reactivity of antibodies in human infections by the kinetoplastid protozoa Trypanosoma cruzi, Leishmania chagasi and Leishmania (Viannia) braziliensis Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo vol.38 no.3 São Paulo May/June 1996

28.-Mita N. Infecciones Mixtas: Identificación de complejos de Leishmania sp y clones de Trypanosoma cruzi por PCR-hibridación en pacientes y mamíferos peridomiciliares de los Yungas, La Paz. Tesis de licenciatura en bioquímica 2001; UMSA.

29.-Chiller TM, Samudio MA, Zoulek G 1990. Reactividad de anticuerpos IgG con antígenos de Trypanosoma cruzi y Leishmania en sueros de pacientes con enfermedad de Chagas y leishmaniasis. Am J Trop Med Hyg 22 : 696-698

30.-Chiaramonte MG, Zwirner NW, Caropresi SL, Taranto NJ, Malchiodi EL 1996. Trypanosoma cruzi y Leishmania spp. Infección mixta humana . Am J Trop Med Hyg 54 : 271-273.

31.-Milena Lenis A. La respuesta celular inmune en la leishmaniasis cutánea americana. Biomedica 1998; 18(4)274-284.         [ Links ]