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Según Luque J1, el síndrome del intestino irritable, la inflamación intestinal, ulceras intestinales y la enfermedad por reflujo gastroesofágico, representan el mayor número de trastornos gastrointestinales. Su tendencia creciente de estas enfermedades digestivas se vincula con una mala alimentación, ingesta de agua o alimentos contaminados con macroorganismos. Motivo por el cual estas enfermedades constituyen un problema médico-social de trascendencia económica a nivel mundial, debido a su alta prevalencia, amplia distribución geográfica, morbilidad y consumo de medicamentos.
Los fármacos no esteroideos (AINEs), constituyen actualmente la clase de medicamentos más recetados y consumidos a escala internacional. Empero, el consumo de estos fármacos por periodos prolongados y en altas concentraciones, se asocian a efectos secundarios como el dolor intestinal, náuseas, vómitos, ulcera estomacal y sangrado; debido a la inhibición de la síntesis de prostaglandinas PGE2 y PGI2, provocando una menor secreción de mono, bicarbonato y disminuyendo el flujo de sangre de la mucosa gástrica2,3.
Los productos vegetales fueron empleados desde la antigüedad por nuestros ancestros, por las actividades biológicas que poseen, debida a metabolitos secundarios, elaborados como parte de su metabolismo normal de los vegetales, siendo estos compuestos químicos responsables de diferentes efectos benéficos para el organismo4,5.
Como expresa Palacios, el LLantén (Plantago major) es una planta que tiene diferentes actividades farmacológicas como, por ejemplo: antitumoral, antidiarreica, antihistamínica, citotóxica sobre células cancerosas, antihipercolesterolémica, analgésica, anticancerígena, cicatrizante, genotóxica, antibacteriana6. Asimismo, de acuerdo con Pucurimay et al., la muña (Minthostachys mollis) una planta medicinal, que crece naturalmente en la región andina de Latinoamérica, es utilizada comúnmente de manera natural como infusión, debido a sus propiedades digestivas y analgésicas reconocidas7.
Es evidente que tanto a nivel nacional, como internacional se necesita realizar investigaciones que permitan incorporar la aplicación de plantas medicinales como alternativa para tratar o prevenir diversas afecciones, motivo por lo cual, la justificación teórica del presente trabajo de investigación, es aportar conocimientos nuevos a la comunidad científica. La fundamentación práctica se enfoca en proporcionar una alternativa de tratamiento natural, a través de un aporte a la sociedad, disminuyendo costos de tratamiento en patológicas mencionadas. La justificación metodológica implica el uso protocolos y técnicas validadas, en la elaboración de los extractos y la infusión de hojas de Muña y Llantén que cumplan controles de calidad físico, químico y microbiológico, proporcionando resultados confiables.
Con base en las consideraciones anteriores, se planteó la siguiente hipótesis: Los extractos y la infusión de hojas de Muña y Llantén, presentan actividad analgésica y gastroprotectora iguales en ratas macho Wistar; por ello, la presente investigación se realizó con el propósito de evaluar la actividad analgésica y gastroprotectora de extractos e infusión de hojas de Muña (Minthostachys mollis) y Llantén (Plantago major), mediante de pruebas biológicas en ratas macho Wistar (Rattus norvegicus).
Material y métodos
Estudio experimental, prospectivo, longitudinal, con enfoque de análisis cuantitativo.
Material Vegetal: Hojas de muña (Minthostachys mollis) y llantén (Plantago major).
Recolección, lavado y desinfección: Las hojas se recolectaron aleatoriamente de distintas regiones del Valle Alto de Cochabamba, se seleccionaron hojas sanas, que se lavaron con abundante agua y desinfectaron con 80 partes por millón de hipoclorito sódico en solución.
Desecación y pulverización: Las hojas fueron secadas de manera artificial, en una cámara de secado con circulación forzada de aire, marca MMM Medcenter, serie venticell a una temperatura de 40 °C por 48 horas. Las hojas fueron pulverizadas en un mortero de porcelana con su respectivo pilón, luego fueron tamizadas en un tamiz N° 40.
Preparación de los extractos: Se prepararon extractos de muña y llantén al 10%, por maceración con etanol:agua (7:3), los cuales fueron filtrados en filtro de papel en un embudo. Este filtrado constituye una solución del extracto, que se concentró en un rotavapor marca Heidolphsu, a 50 °C, 190 rpm de velocidad de rotación del balón y 40 mbar de presión de vacío, hasta eliminar 3/4 del solvente, los cuales fueron llevados a refrigerado entre 2 a 8 °C, para su conservación.
Elaboración del fitofármaco: El producto elaborado fueron bolsitas de té, las cuales contenían un gramo de hojas molidas de muña y llantén, empleadas como infusión.
Evaluación de la calidad de extractos e infusión: a) Control organoléptico: Los parámetros evaluados fueron color, olor, sabor y aspecto. b) Control fisicoquímico y microbiológico: El análisis fisicoquímico y microbiano se llevó a cabo en los ambientes del Laboratorio de Nutrición y Alimentos, de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas.
Identificación de metabolitos secundarios: Los metabolitos secundarios fueron identificados, mediante la metodología de Olga de Lock 8.
Animales de experimentación: Ratas macho Rattus norvegicus con peso entre 191-218 g, procedentes del bioterio de la Universidad Mayor de San Andrés, aclimatados en jaulas metálicas individuales y en condiciones ambientales, por 7 días, se les proporciono agua clorada y alimento por la mañana con una proporción de 1.5 g por 10 g de peso. Criterios de inclusión: Ratas Wistar, de la misma cepa, edad, sexo y peso aproximado. Criterios de exclusión: Ratas de diferente cepa y empleados en un ensayo anterior.
Patrón antiulceroso: Omeprazol de la Compañía Farmacéutica SAE S.A., disuelto en agua destilada, administrado en una dosis de 20 mg por kg de peso del animal. Patrón analgésico: Tramadol clorhidrato, Laboratorio Quinfa, ampolla de 100 mg/2ml disuelto en agua destilada administrado en una dosis de 20 mg por kg de peso. Agente ulcerogénico: 1ml de etanol absoluto por 200 g de peso del animal.
Agente inductor de contorsiones: Ácido acético glacial (0,6%) 1 ml por 200 g de peso del animal.
Las Técnicas de inducción de contorsiones abdominales con ácido acético glacial y de lesiones gástrica con etanol absoluto, fueron estandarizadas en los ambientes de Laboratorio del Centro de Investigación de Fármacos, Alimentos y Cosméticos (CEFAC), se utilizó agua destilada como solvente para disolver los extractos. La dosis administrada del agente de contorsiones y ulcerogénico fue de 1ml por cada 200 g peso del animal; debido a que, los animales morían cuando se les administraba dosis superiores a 1,5 ml.
Evaluación de la actividad analgésica: Se siguió el método de Vogel9, de contorsión abdominal inducida con ácido acético glacial. Se emplearon 18 ratas divididas en 6 lotes: lote 1 tratado con agua destilada (control negativo), lote 2 (control positivo), tratado con tramadol, lote 3 tratado con extracto de muña, lote 4 tratado con extracto de llantén, lote 5 tratado con extractos combinados y lote 6 tratado con infusión de muña y llantén.
Las ratas macho Rattus norvegicus estuvieron en ayunas por 24 horas antes del inicio del experimento, durante las cuales solo se les permitió beber agua ad libitum. Se les administro extractos e infusión en una dosis de 500 mg por Kg peso, por vía peritoneal 30 minutos antes de administrarle ácido acético glacial, en proporción de 1 ml por 200 g de peso de la rata, los cuales luego fueron aislados en jaulas individuales para observar por 30 minutos el número de contorsiones abdominales.
La actividad analgésica y su efectividad se calcularon, mediante las siguientes fórmulas:
Evaluación de la actividad gastroprotectora: esta actividad se evalúa por el método de Arroyo10. Se utilizaron 12 ratas distribuidas en 6 lotes. lote 1 tratado con agua destilada (control negativo), lote 2 (control positivo), tratado con omeprazol, lote 3 tratado con extracto de muña, lote 4 tratado con extracto de llantén, lote 5 tratado con extractos combinados y lote 6 tratado con infusión de muña y llantén
Las ratas macho Rattus norvegicus estuvieron en ayunas por 24 horas antes del inicio del experimento, durante las cuales solo se les permitió beber agua ad libitum. Se les administro extractos e infusión en una dosis de 500 mg por Kg peso, por vía oral media 30 minutos antes de administrar 1 ml de etanol absoluto por 200g de peso de la rata. Después de 60 minutos de administrarles el agente ulcerogénico, se procedió a sacrificar a las ratas con cloroformo por asfixia, enseguida se realizó una laparotomía en el tercio anterior medio del abdomen para extraer el estómago, el cual se lavó suavemente con un chorro suave de agua. Luego se desplegó el estómago sobre un plastoformo utilizando alfileres. Se analizó la severidad de las lesiones gástricas mirando al microscopio estereoscópico, procediéndose al conteo del número y el tamaño de las lesiones en milímetros, la actividad gastroprotectora y su efectividad, se calcularon con las siguientes fórmulas:
Análisis estadístico: Los datos fueron recolectados mediante las técnicas de observación y revisión documentada, en una planilla elaborada en la que se incluyeron variables necesarias, para la realización del trabajo. Se utilizo el programa estadístico SPSS versión 25, para el análisis de los datos, se calcularon frecuencia absolutas y relativas, para la descripción y comparación de variables. Para determinar si los datos eran de distribución normal se realizó la prueba de contraste de normalidad de Shapiro-Wilk para muestras pequeñas. La prueba estadística ANOVA de un factor de Kruskal-Wallis, se utilizó para comparar medias entre 3 o más grupos, con una significancia estadística de p<0,05, al 95% de confianza.
Las consideraciones éticas en esta investigación, se enmarcaron en los lineamientos de la declaración de Helsinki, actualizada en la asamblea general de la asociación médica mundial, en Fortaleza Brasil, octubre 2013; así como las declaraciones de la Asociación Médica Mundial sobre el de Animales en la Investigación Biomédica, reafirmada por la 203a Sesión del Consejo de la AMM, Buenos Aires, Argentina, abril 2016 y los lineamientos dados por el comité de bioética de la Facultad de Bioquímica y Farmacia, de la Universidad Mayor de San Simón11,12.
Resultados
Los resultados del porcentaje de actividad analgésica de los extractos etanólico y la infusión con relación al número de contorsiones inducidas con ácido acético glacial al 0,6%, fue de 57,1% para el extracto muña, 72,1% para el extracto de llantén, 76,4% para extractos combinados y 81,4% para la infusión.
Con respecto a la efectividad comparada con el control positivo para el extracto de muña fue 70,8%, extracto de llantén 89,4%, extractos combinados 94,7% y mayor del 100% para la infusión (ver Tabla 1).
Tabla 1 Porcentaje de la actividad analgésica y efectividad de los tratamientos aplicados, según el número de contorsiones
Nota: ppm: partes por millón = mg por Kg de peso.
Fuente: Elaboración propia, según base de datos
La actividad gastroprotectora, en función al número de lesiones generadas con el agente ulcerogénico (ver tabla 2), para el extracto de muña fue del 50%, con una efectividad del 83,33%, para el extracto de llantén 40%, con una efectividad del 66,67%, mismo actividad y efectividad para los extractos combinados y para la infusión fue 60%, con una efectividad del 100% (ver Figura 1).
Tabla 2 Número de lesiones y grado de lesiones inducidas por etanol absoluto, en los tratamientos aplicados
Nota: ppm: partes por millón = mg por Kg de peso.
Fuente: Elaboración propia, según base de datos
Fuente: Microsoft Excel 2016, en función a la base de datos.
Figura 1 Porcentaje de la actividad gastroprotectora de los extractos e infusión, según el número de lesiones inducida por el etanol absoluto, con respecto al control negativo; porcentaje de la efectividad gastroprotectora de los extractos e infusión, con respecto al control positivo.
Según el grado de la lesión en milímetros (ver Tabla 2), la gastroprotección fue del 62,7% para el extracto de muña, con una efectividad del 86,5%, para el extracto de llantén 50%, con una efectividad del 68,9%, para los extractos combinados del 53,9%, con una efectividad del 74,3% y para la infusión 69,6%, con una efectividad del 95,9% (ver Figura 2).
Fuente: Microsoft Excel 2016, en función a la base de datos.
Figura 2 Porcentaje de la actividad gastroprotectora de los extractos e infusión, según el número de lesiones inducida por el etanol absoluto, con respecto al control negativo; porcentaje de la efectividad gastroprotectora de los extractos e infusión, con respecto al control positivo.
Valores de p=0,05 (0,000138 número de contorsiones abdominales, 0,004 número de lesiones y 0,022 para el grado de lesión) de la prueba estadística de contraste de normalidad de Shapiro-Wilk, determinaron que nuestra variable de interés no cuenta con distribución normal. Motivo por el cual se realizó la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis, que nos permitio concluir que con una probabilidad menor al 5% (p=0,013) aceptamos que la actividad analgésica de los tratamientos aplicados, según el número de contorsiones no es la misma, con respecto a la actividad gastroprotectora con una probabilidad mayor al 5% con valores de p=0,167 para el número de lesiones y p=0,384 para el grado de lesión, aceptamos que el porcentaje de la actividad gastroprotectora y la efectividad de los tratamientos aplicados es la misma, no habiendo diferencia significativa, resultados con un nivel de confianza del 95%.
En lo que concierne al control fisicoquímico y organoléptico de los extractos y la infusión, los resultados fueron los siguientes: Densidad: muña 1,024, llantén 1,16, infusión 0,99; índice de refracción; muña 1,4, llantén 1,3, infusión 1,3; pH; muña 5,05, llantén 5,27, infusión 6,91, color; muña café, llantén ámbar, infusión amarillo verdosos, olor; muña herbal, llantén mentolado, infusión característico, sabor; muña amargo astringente, llantén amargo picante, infusión característico (ver Tabla 3).
Tabla 3 Número de lesiones y grado de lesiones inducidas por etanol absoluto, en los tratamientos aplicados
Fuente: Elaboración propia, según base de datos.
Con respecto a la marcha fitoquímica preliminar, los metabolitos secundarios identificados, en la muña y el llantén fueron: Compuestos fenólicos; abundante concentración, flavonoides; moderada concentración, saponinas moderada concentración en la muña, escasa concentración en el llantén y alcaloides; entre abundante a moderada concentración en la muña y entre moderada a escasa en el llantén (ver Tabla 4).
Tabla 4 Machar fitoquímica preliminar
Nota: Baja concentración (+), moderada concentración (++),alta concentración (+++)
Fuente:Elaboración propia, según base de datos
El control de calidad microbiana reportó: Ausencia de bacterias patógenas en los extractos y la infusión.
Discusión
Los resultados de la presente investigación reportaron interacción entre la muña y llantén en concentración establecida en forma de infusión, presentando una actividad analgésica superior a los efectos en sus formas de extractos e incluso superando al mismo control positivo, resultados similares a los de León13.
Empero, diferentes al estudio de Rafael Castro14, en el que los resultados mencionan que el efecto es igual, mientras en el estudio por Ramos et al.15, en el cual el tramadol como control positivo tenía mejor efecto analgésico que los extractos de plantas probados; Estos resultados nos permiten plantear la posibilidad sinergia que, por su mecanismo de acción, correspondería a un efecto potenciador. Asimismo, las bases bioquímicas sustentarían el efecto de sinergismo observado en este estudio, debido a que la muña y el llantén presentan metabolitos secundarios (flavonoides, taninos, alcaloides y esteroides) compuestos químicos encargados de la actividad analgésica6,16-20.
La validación estadística demuestra que la actividad analgésica, en el estudio hay una diferencia significativa entre los tratamientos aplicados al igual, que los resultados obtenidos por Ramos et al.15, Llontop et al21.
Respecto a la actividad gastroprotectora los extractos de muña y llantén tiene un menor efecto que el omeprazol, en comparación con la infusión que presento el mismo efecto frente a este fármaco e incluso con una efectividad del 100%, resultados similares a los de castillo20, pero opuestos a los estudios de Chirri18, en el extracto de llantén presento mejor actividad gastroprotectora en comparación con el omeprazol, Baez22 donde la Muña presento menor actividad.
Los resultados demuestran la no existencia de diferencia significativa en el número de lesiones entre los lotes a los que se les administró Omeprazol e infusión, corroborando que la administración de estos tratamientos son igualmente efectivos, al igual que en los estudios realizados por Chiri18, Castillo20 y Llontop et al.21. Al igual que en la actividad analgésica, las bases bioquímicas explicarían que hay un efecto sinergismo en la actividad gastroprotectora igualmente en la muña y el llantén presentan por sus metabolitos secundarios presentes los que serían responsables de ambas actividades6,16-20
