ARTÍCULO ORIGINAL

 

Existencia y supervivencia de esporas de variedades de Bacillus thuringiesis en granos de almacén

 

Presence survival spores of Bacillus thuringiensis varieties in grain warehouse

 

 

Sánchez-Yáñez Juan Manuel¹*, García-Ortiz Vanessa Ruby¹, Ulibarri Gérard², Hernández-Escareño Jesús Jaime³

¹Microbiología Ambiental. Ed B-3, Instituto de Investigaciones Químico Biológicas, Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Francisco J. Mujica s/n. Col. Felicitas del Rio, CP 58000, Morelia, Michoacán, México.
²Department of Chemistry and Biochemistry. Laurentian University 935 Ramsey Lake Rd. Sudbury, Ontario P3E2C6, Canadá.
³Microbiología y Micología Veterinaria, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Nuevo León, Campus de Ciencias Agropecuarias, Av Fco Villa S/N Col Ex –Hacienda, “El Canada Escobedo, NL, México.

*Dirección de contacto: Microbiología y Micología Veterinaria, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Nuevo León, Campus de Ciencias Agropecuarias, Av Fco Villa S/N Col Ex –Hacienda, “El Canada”, Escobedo, NL, México.

Jésus Jaime Hernandez-Escareño
E-mail address : jjescareno@hotmail.com

Historial del artículo. 

Recibido enero, 2016.
Devuelto mayo 2016
Aceptado julio, 2016.
Disponible en línea, agosto, 2016.

 

 

---

Resumen

El género de Bacillus thuringiensis (Bt) sintetiza esporas y cristales tóxicos para insectos-plaga agrícolas. La especie de Bt es cosmopolita, por lo que es posible aislar subespecies de granos almacenados dado que las esporas persisten por más tiempo ahí que en la intemperie. Los objetivos del trabajo fueron: i) aislar subespecies de Bt de granos almacenados ii) evaluar la toxicidad de esos Bt en Spodoptera frugiperda y Shitophilus zeamaisese iii) analizar la persistencia de esas esporas en granos de Zea mays almacenados y expuestos al ambiente abierto. Los resultados indican que existen esporas de subespecies de Bt en granos almacenados. De acuerdo con el aislado Bt1 o Bt2 fueron tóxicos para S. frugiperda y S. zeamaisese. Se sugiere que una de esos Bt fue la var morrisoni. Esas esporas en granos de Z. mays almacenado superviveron más tiempo, que las expuestas a la radiación solar, eliminadas por radiación solar biocida.

Palabras clave: Esporas, subespecies, supervivencia, efecto solar, biocida.

---

Abstract

Genus Bacillus thuringiensis (Bt) synthesized spores and crystals toxic to pest-insects in agriculture. Bt is comospolitan then possible to isolate some subspecies or varieties from warehouse. The aims of study were: i) to isolate  Bt varieties from grain at werehouse ii) to evaluate Bt toxicity  on Spodoptera frugiperda and Shitophilus zeamaisese iii) to analyze Bt spores persistence in Zea mays grains at werehouse compared to same Bt on grains exposed to sun radiation. Results showed that at werehouse were recovered more than one variety of Bt spores. According to each isolate Bt1 o Bt2 were toxic to S. frugiperda or S. zeamaisese. One those Bt belong to var morrisoni. At werehouse these spores on Z. mays grains surviving more time, while   the same spores exposed to boicide sun radiation they died.

Key words: Spores, subspecies, survival, biocide sun radiation.

---

 

 

Introducción 

Los insectos-plaga (IP) son uno de los principales factores que limitan la producción agrícola. Atacan los cultivos vegetales (CV) desde su siembra a la cosecha e incluso como granos en su almacenamiento. Lo anterior obligó a que en el siglo XX se empleara en forma intensa el Diclorodifenildicloroetano (DDE) y otros organoclorados durante el ciclo completo de CV para protegerlos del ataque de los IP, desde su etapa de huevecillo hasta el adulto (Rowe et al. 1987, Dumalge 1970). La aplicación de plaguicidas químicos protege CV, pero en los IP alrededor de 500 especies se indujo resistencia genética. En consecuencia a finales de los años 80 se reportan numerosos casos de tolerancia a una o más tipos de insecticidas (Georghio 1990, Herrero et al. 2001a, Sánchez-Yáñez & Peña-Cabriales 2000). Mi entras los plaguicidas contaminan el agua, el aire y el suelo y su espectro biocida puede incluir insectos benéficos (Martin & Travers 1989, Lambert & Peferoen 1992). Otra alternativa para el control de IP, es el microbiológico con ventajas sobre el químico por su especificidad, e inocuidad a humanos, animales o plantas y de un relativo bajo costo (Herrero et al. 2001b, Lightwood et al. 2000).Un ejemplo de bioplaguicida es el género de bacteria entomotóxica y/o entomopatógeno Bacillus cuyas especies son: B. thuringensis (Bt), B. popilliae, B. larvae y B. sphaericus (de Maagd et al. 2000, Pinnock et al. 1971, Kaelin et al. 1994) Bt se aplica comercialmente desde la mitad del siglo XX (Kiselek1974, Lambert & Peferoen 1992, Luna-Olvera & Peña-Cabriales 1993). Bt durante su esporulación genera un cristal o cuerpo paraesporal, también conocido como δ-endotoxina, tóxica para IP de los órdenes: díptera, coleóptera y lepidóptera e inclusive nematodos fitoparasitos (Rowe et al. 1987, Moir & Smith 1990, Schnepf et al. 1998, Tabashnik et al. 2000). El bioplaguicida basado en Bt es clave en la reducción de la aplicación de plaguicidas químicos y evitar la contaminación ambiental como práctica agrícola de protección de los CV (Pinnock et al. 1974, Ignoffo & Garcia 1978, Griego & Spence 1978). Al respecto al menos el 80% del mercado de bioinsecticidas lo cubren productos de Bt, normalmente se emplean como primera elección en el manejo integral de IP, (Rowe et al. 1987, Lambert & Peferoen 1992, Wirth et al. 2001).Un problema de la aplicación de Bt es la breve persistencia de sus esporas en el ambiente abierto (Sánchez-Yáñez & Peña-Cabriales 2000, Pinnock et al. 1974, Ignoffo & Garcia 1978, Benoit et al. 1990) debido a que el cristal entomotóxico se sintetiza con parte de la pro-teína, le da resistencia a la radiación solar, le brinda protección mecánica, tolerancia a sustancias químicas del tipo de los biocidas en consecuencia la exposición del complejo espora/cristal a la luz, causa la desnaturalización del cristal y muerte de la espora (Kiselek 1974, Luna-Olveda & Peña-Cabriales 1993 , De Amorin et al. 2001).A pesar de ello, las esporas de Bt se recuperan con relativa facilidad de un amplio número de nichos ecológicos (Moir & Smith 2009, Martin & Travers 1989, Sayyed et al. 2000) Es posible detectar esporas de Bt en función de la fu ente de aislamiento: agua, suelo, filoplano de plantas, larvas de insectos enfermas, productos almacena dos y alimentos balanceados para animales de granja (Martin & Travers 1989, Meadows et al. 1992, Smith & Couche 1991). Sin embargo, si existe diferencia entre la frecuencia de aislamiento de las sub especies de Bt y las esporas de un ambiente en específico, entre de uno abierto y/o cerrado como el al macén de granos ahí superviven por más tiempo (Lambert & Peferoen 1992, Dumalge 1970, Itoua-Apoyolo et al. 1995) en especial del suelo (Martin & Travers 1989, Meadows et al. 1992, Smith & Cou che 1991). Por lo general la supervivencia de las esporas de Bt, depende del ambiente específico de ubicación (Rowe et al. 1987, Sánchez-Yáñez & Pe-ña-Cabriales 2000, Audtho et al. 1999, Kalfon & Barjac 1985. Al respecto se reporta que la persistencia de las esporas de Bt aplicadas foliarmente, fue limitada en hojas o filosfera de Phaseolus vulgaris y Zea mays, en las que registró un tiempo viable que no fue mayor de 72 h, resultado de la actividad biocida de la radiación solar (Sánchez-Yánez & Peña-Cabriales 2000, Meadows et al. 1992). En contraste en alimentos balanceados para animales o granos almacenados, se reportó una supervivencia de sema nas, con un porcentaje del 7% de recuperación de las esporas de (Rowe et al. 1987, Martin & Travers 1989, Dumalge 1970, Itoua-Apoyolo et al. 1995). Un ejemplo de lo anterior son las hojas de Nicotiana tabacum en almacén, de las que se aisló un porcentaje similar de esporas de Bt detectadas en semillas almacenadas (Kaelin et al. 1994, Sayyed et al. 2000, Hua et al. 2001, De Amorin et al. 1991). Lo que apoya la mayor probabilidad de recuperación de estas formas de resistencia de Bt en almacén en un ambiente protegido de la radiación solar (Benoit et al. 1990, Griego & Spence 1978), que de un abierto como cuando el complejo espora/cristal se asperja en hojas y granos de plantas expuestas directamente a esa radiación (Luna-Olveda & Peña-Cabriales 1993, Smith & Couche 1991) En el ambiente de almacén de granos se sospecha la existencia de esporas de Bt de más de una variedad, serotipo o sub especie, siendo que principalmente son esos sitios cerrados donde se han reportado epizootias en IP causadas por Bt, lo sugiere que debido al número de esporas viables de la bacteria que son suficientemente, para causar una intoxicación e infestación masiva de los IP (Rowe et al. 1987, De Amorin et al. 2001, Wirth et al. 2001, Dumalge et al. 1990). Con base en lo anterior los objetivos de este trabajo fueron: i) detectar esporas de más de una subespecie de Bt en granos de almacén ii) evaluar la toxicidad de esos Bt en Spodoptera frugiperda y Shitophilus zeamais iii) analizar la persistencia de esporas de Bt en grano de Zea mays en ambiente de almacén y expuestos a la intemperie.

 

Materiales y métodos

Origen de las muestras. Se colectaron 84 diferentes muestras de granos de almacén y residuos con diferente tiempo de almacenamiento de los mercados de San Juan, Independencia y Vasco de Quiroga localizados en la Ciudad de Morelia, estado de Michoacán, México.

Recuperación de las esporas de Bacillus thuringiensis. Para el aislamiento de las esporas de Bt se suspendió 1.0 g/de granos o residuos en tubos de 18X150 mm con 10.0 mL de NaCl 0.85% p/v (solución salina y detergente comercial al 0.001%), los tubos se agitaron/5.0 min en un vórtex (Thermolyne). Los granos con daño por insectos se trituraron y posteriormente con los granos enteros se pasteurizaron a 65 °C/13 min, e inmediatamente se enfriaron durante 7 min en baño de hielo. Para aumentar la posibilidad de la recuperación de esporas de esas muestras se tomó 0.1 mL del pasteurizado y se inoculó en tubos con 10.0 mL de caldo nutritivo (Bioxon) g/L: peptona gelatina 5.0, extracto de carne de res 3.0 pH 6.9, luego se incubo por 24 h, y resembraron por estría en cajas con agar nutritivo (Bioxon) g/L: peptona gelatina 5.0, extracto de carne de res 3.0, agar 15.0, pH 6.9, las cajas con agar nutritivo se incubaron a 30 °C/72 h. Para buscar las colonias típicas de Bt y por microscopia de la luz detectar su cristal y espora característicos (Audtho et al. 1999, Sayyed et al. 2000).

Conservación de las esporas de Bacillus thuringiensis. Los aislados de Bt se resembraron en caldo nutritivo, se incubaron a 30 °C por 72 h, se suspendieron en NaCl 0.85% (solución salina), se mezclaron en turba estéril (121 °C por 2 h) en viales 4 mL con tapón de rosca, se mantuvieron en refrigeración a 10 °C para mantener la viabilidad de esas esporas (Luna-Olvera & Peña-Cabriales 1993, Sánchez-Yáñez 2007).

Microscopia electrónica de los aislados de Bacillus thuringiensis. Para la observación de las esporas y cristales producidos por Bt1 y Bt2 (código usado para su identificación) de los aislados de los granos y residuos almacenados. Se utilizó el microscopio electrónico de barrido (MEB) JEOL Modelo JSM 6400, del Instituto de Investigaciones Metalúrgicas (IIM) de la Universidad Michoacana San Nicolás de Hidalgo (UMSNH), Morelia, Mich, México. Para ello se tomó una asada de cada Bt y se fijó en una placa metálica (1 x 1 cm), luego las placas se sumergieron en glutaraldéhido/45 min., y se deshidrataron en alcohol absoluto para la observación al MEB, se recubrieron con una capa de oro, y se tomaron las microfotografías 5000 y 10000 magnificaciones (Itoua-Apoyolo et al. 1995, Schnepf et al. 1998)

Marcaje de los aislados y cepa de HD-1 de Bacillus thuringiensis. La persistencia de las esporas en los granos de Zea mayz en almacén y a la intemperie se seleccionó Bt2, por su abundancia y como comparación se usó la cepa comercial de Bt HD-1(usada como referencia por ser una cepa standard para medir la toxicidad de las esporas/cristales de otras variedades de Bt, respecto a diversas órdenes de insectos). Se diseñaron tres medios de cultivo selectivos para la recuperación de las esporas de Bt con base a su patrón de susceptibilidad a los antibióticos de un Multidisco^*MR Gram positivo (Sanofi). La cepa HD-1 con resistencia a ampicilina en AN, agregada estéril por filtración con membrana millipore (Gelman, Co) en concentración de 1500 µg/mL (Lakeside), para recuperar Bt1 al AN se adiciono ampicilina 850 µg/mL (Lakeside), para recuperar Bt2 al AN se agregó 750 µg/mL del mismo antibiótico en la forma señalada. Para inhibir el crecimiento de hongos en el AN se usaron 100 U/mL de nistatina (Sánchez -Yáñez & Peña-Cabriales 2000; Ignoffo & Garcia 1978).

Producción y recuperación del complejo espora/ cristal de Bacillus thuringiensis. Para la fermentación del complejo espora/cristal del aislado: Bt1 y Bt2 individualmente se crecieron en caldo soya trip ticasa o CST (Bioxon) e incubaron a 30 °C  por 96 h para observar al microscopio el 95% de las esporas/cristales. El CST se centrífugo a 10000 rpm por 10 min, finalmente, el complejo espora-cristal de cada aislado se recuperó por el método de coprecipitación lactosa-acetona (Dumalge 1970, Dumalge et al. 1990).

Supervivencia de esporas de Bacillus thuringiensis en granos de almacén y expuestos al ambiente. Las esporas y cristales de Bt1, Bt2 y HD-1, se ajustaron a 4.0 x 10⁶ esporas/semilla, se asperjaron en 300 granos de Z. mays. Estos granos se colocaron en costales de polipropileno de 150 x 100 cm, para si-mular la forma como se conserva en almacén, los costales se introdujeron en un espacio similar al am-biente de un almacén condiciones micro climáticas promedio fueron: temperatura de 20 °C humedad re lativa del 10%. Para registrar el tiempo de supervivencia de las esporas, se analizaron 100.0 g de c/grano a intervalos de 24 h por la técnica de cuenta viable en placa, para facilitar la disgregación de las esporas unidas a los granos, la solución salina se sustituyó por una de triptona (Difco) al 0.1 %  y 10 ppm de N-laurilsarocosine sodium salt o LSD (Sigma). Luego se determinó la densidad de la población de Bt en granos con y sin pasteurización. Además, en el Z. mays asperjado se expuso al ambiente abierto (intemperie) para registrar el efecto de la radiación solar sobre el tiempo de supervivencia de esas esporas de Bt a intervalos de 12 h, se tomaron 100.0 g de este grano de la manera descrita con los almacenados (Sánchez-Yáñez 2007, Itoua-Apoyolo et al. 1995)

Análisis estadístico. Se realizó con una prueba estadística t-Student comparación de medias de Tukey para analizar la persistencia esporas de Bt en los granos de Z. mays en ambiente de almacén  así como en la intemperie (Sáncrez-Yáñez & Peña-Cabriales 2000, Sáncrez-Yáñez 2007).

 

Resultados

En la figura 1 se muestra la microfotografía electrónica de barrido de las esporas y cristales amorfos o los diferentes tipos de δ-endotoxina sintetizados por Bt2 producidos en un cultivo de 96 h de incubación (Rowe et al. 1987, Schnepf et al. 1998, Dumalge et al. 1990).

En la figura 2 se muestra una magnificación del cristal sintetizado por Bt1, recuperado de granos en almacén. En ella se observan cristales rectangulares cúbicos e incluso amorfos, evidencia que sugiere que en los granos en almacén podría existir más de una variedad de Bt distinta a la morrisoni, como la kurstaki que normalmente no se recupera de ambientes distintos a la de los granos almacenados (Martin & Travers 1989, Meadows et al. 1992).

La tabla 1 muestra el análisis bacteriológico de 84 diferentes granos y sus residuos obtenidos de almacenes para su conservación, usados como fuente de aislamiento de los Bt, observados al microscopio electrónico de barrido se detectaron dos tipos morfológicos de cristales como se muestra en las microfotografías al MEB señaladas en la figura 1, con cristales bipiramidales típicos de algunas variedades de Bt2 que intoxican lepidópteros como la subespecie kurstaki (Rowe et al. 1987, Herrero et al. 2001a) mientras que en la figura 2 se observan el complejo espora-cristal que generalmente son similares a lo reportado para Bt recuperados de ambientes cerrados como lassubespecie morrisoni de Bt (Martin & Travers 1989, Meadows et al. 1992)

En la figura 3 se muestra que Bt1 y Bt2 cultivados en CST generaron complejo espora cristales que causaron un 100% de mortalidad en S. frugiperda que corresponde a Bt var. kurstaki (Itoua-Apoyolo et al. 1995, Audtho et al. 1999).

En tanto que ambos Bt reproducidos en CN sintetizaron un complejo espora cristales menos tóxicos contra S. frugiperda con un 60% de mortalidad, algo similar se observó cuando estos aislados se crecieron en CSTL, Bt1 produjo el complejo espora/cristal de baja toxicidad contra S. frugiperda con un 40% de mortalidad. Mientras que Bt2 mantuvo el 60% en el mismo lepidóptero, resultado de la composición química del medio de reproducción (Rausell et al. 2000, Schnepf et al. 1998, Dumalge et al. 1990).

En la figura 4 se presenta como el complejo espora-cristal de Bt1 fue tóxico para Shitophilus zeamaise en función de la composición química del medio de cultivo en el que se reprodujo (Dumalge 1970, Klanfon & De Barjac 1985, Sayyed et al. 2000, mientras que en el CN el por ciento de mortalidad fue del 30%, cuando Bt1 se creció en CST tuvo toxicidad del 18%; en contraste al cultivado en CSTL no causó ninguna mortalidad en larvas de S. zeamaise.

Estos resultados apoyan que de acuerdo con la toxicidad del complejo esporas/cristales son específicos para determinados ordenes de IP (Rowe et al. 1987, Schnepf et al. 1998, Dumalge et al. 1990), e indican que se trata de una variedad de Bt diferente a kurstaki (Rowe et al. 1987, Georghiou 1990, Maagd et al. 2000) y que se mostró en las microfotografías electrónicas de barrido, está subespecie sintetiza un tipo de cristal no romboide típico, el más conocido para Bt var. kurstaki (Herrero et al. 2001a, Herrero et al. 2001b, Tabashnik et al. 2000).

La tabla 2 se presenta el tiempo de supervivencia de las esporas de Bt2 y Bt var. kurstaki HD-1 en granos de Z. mays almacenados a temperatura promedio de 20 °C±1 y humedad relativa del 10%. Mientras que a la intemperie la temperatura mínima fue 10 °C a las 5 AM, de 25 °C a las 12 AM, de 35 °C a las 16 pm, con una humedad relativa de 40%, entre las17-19 pm y del 30% en el resto del tiempo. Se observó que las esporas de Bt1 y Bt2 así como las HD-1 fueron viables más tiempo cuando los granos de Z. mays se almacenaron por más de 21 días, (en la tabla se omitió la relación de la supervivencia de las esporas de Bt1 en almacén, porque no fue estadísticamente diferente a lo registrado con Bt2). En evidente contraste con el menor tiempo de supervivencia de las esporas de Bt expuestas a la radiación solar responsable del efecto biocida, ya que a los 18 días posteriores del inicio del ensayo ya no se detectaron esporas viables de Bt en ningún caso (Sánchez-Yáñez & Peña-Cabriales 2000, Griego & Spence 1978).

En la tabla 3 se muestra el perfil bioquímico complementario usado en la identificación de los Bt de granos de almacén como la subespecie morrisoni, con diferencia en la capacidad de hidrolisis de caseína, en los aislados de Bt de esta investigación, este dato fisiológico al igual que la toxicidad de los cristales contra S. zeamais, y el tipo morfológico de cristales observados, en los medios de cultivo usados en la generación del complejo espora/cristal, y reafirma que se trata de una variedad de Bt diferente a kurstaki (Dumalge et al. 1990).

En la figura 5 se muestra el gel de agarosa con los plásmidos de Bt aislados de granos en almacén, de acuerdo con el método de extracción de ADN extra cromosómico (Kieser 1984), después de que Bt se cultivó en CN con naranja de acridina y el SDS para la eliminación de los plásmidos para luego repetir la extracción del ADN (Kieser 1984). Resultado de este ensayo estos plásmidos ya no se detectaron, aunque Bt creció normalmente en CN, además de que no formaron los típicos cristales. Con lo que se demostró que la síntesis de estos plásmidos y cristales estaban directamente relacionados, como la señala literatura para las subespecies o variedades de Bt (Hua et al. 2001, De Amorin et al. 2001, Griego & Spence 1978).

 

Discusión

De acuerdo con lo reportado con los resultados mostrados basados en la morfología ultramicroscópica de los cristales de Bt, la toxicidad del complejo espora/cristal contra S. frugiperda y S. zeamais, el per fil bioquímico, sugiere la existencia de una subespecie de Bt var. morrisoni en granos almacenados. Con el bioensayo horizontal se probó que Bt1 causo una mortalidad de un 90% en S. frugiperda un IP de cultivos agrícolas en campo abierto (Lightwood et al. 2000, Kaelin et al. 1994), al MEB la morfología de sus cristales sugiere que Bt1  pertenece a la var kurstaki (de Maagd et al. 2000, Schnepf et al. 1998) . Similar a lo reportado para Bt subespecie morrisoni (Rowe et al. 1987, Herrero et al. 2001a, Herrero et al. 2001b). Es probable que el movimiento de los granos desde el campo hasta el almacén haya facilitado su contaminación con esporas de Bt subespecie kurstaki y la morrisoni a pesar de que ambas variedades sean distintas, su viabilidad es relativamente corta cuando se exponen a la luz, consecuencia de que parte de la proteína que se destina para el cristal se suprime de la cubierta de la espora, lo que la hace susceptibles a la acción biocida de la luz solar (Igno ffo & Garcia 1978, Martin & Travers 1989, Benoit et al. 1990, Griego & Spence 1978), en especial cu ando no se almacenan, en contraste si los granos colectados evitan la luz solar, existe alguna evidencia de que podrían preservarse en un almacén desde semanas a meses (Rowe et al. 1987, Luna-Olvera & Peña-Cabriales 1993), esta ruta es una forma de dispersión de las esporas (Lambert & Peferoen 1992, Schnepf et al. 1998), la presencia de más de una subespecies de Bt en granos se ha hipotizado y depende del momento de almacenamiento independientemente del tipo y tamaño de los granos (Rowe et al. 1987, Klanfon & De Barjac 1985). En esta investigación fue relativamente sencillo determinar el por ciento de aislamiento de las esporas de Bt a partir de los diversos granos, este porcentaje fue diferente o mayor al que se reporta en ambientes abiertos (expuestos a la luz solar) como el agua, el suelo o las hojas de plantas (Sánchez-Yáñez & Peña-Cabriales 2000, Martin & Travers 1989, Lambert & Peferoen 1992, Luna-Olvera & Peña-Cabriales-1993). Existe cierta tendencia a detectar el mayor porcentaje de recuperación de esporas de Bt en almacén (Meadows et al. 1992). Alguna información señala que granos recién cosechados expuestos a la luz directa del sol, contenían un número limitado o nulo de esporas viables de Bt (Pinnock et al. 1974, Ignoffo & Garcia 1978, Griego & Spence 1978), pero aquellos colectados y almacenados inmediatamente por más de 2 a 3 semanas, se les detectaron esporas viables de Bt (Meadows et al. 1992, Kaelin et al. 1994, Smith & Couche 1991). Esto hace suponer que el periodo de cosecha de granos es crítico por el contacto con los insectos saprobios, los pájaros y sus desechos que transportan esporas de Bt  (Rowe et al. 1987, Luna-Olvera & Peña-Cabriales 1993), y sugiere que el almacenamiento de los granos favorece la viabilidad y diversidad de subespecies de esporas de Bt, al igual que la baja humedad (Martin & Travers 1989, Lambert & Peferoen 1992). Aunque no se ha afirmado categóricamente también se hipotiza que en ausencia de luz solar la persistencia de las esporas es mayor que expuestas a la radiación solar (Benoit et al. 1990, Griego & Spence 1978), además sugiere que los granos almacenados contienen esporas de diferentes subespecies de Bt (Rowe et al. 1987, Schnepf et al. 1998, Benoit et al. 1990). Este hecho se probó en la actual investigación, dado que se detectaron cristales con morfología: romboidales o bipiramidales y amorfos como se muestra en las microfotografías al MEB mostradas en las figuras 1 y 2 recuperados en diversos gra nos y los residuos, una características morfológica definida en las distintas subespecies de Bt (Herrero et al. 2001a, De Maagd et al. 2000, Meadows et al. 1992, Klanfon & De Barjac 1985), al igual que en los lugares relacionados con la industria de alimentos para animales de granja (Kaelin et al. 1994, Dumalge 1970, Klanfon & De Barjac 1985). Otra evidencia de la existencia de más de una subespecies de Bt, fueron bioensayos horizontales con S. frugiperda y S. zeamaise (Sayyed et al. 2000, Hua et al. 2001, Tabashnik et al. 2000, Wirth 2001) En principio porque Bt sintetiza una clase específica de cristales entomotóxicos acorde con las distintos órdenes de IP, por lo que la diferencia en la toxicidad de la δ-endotoxina es dependiente de la variedad de Bt, de su origen y el medio de cultivo que se usa para la síntesis de ese complejo espora-cristal. Este hecho se comprobó en el bioensayo horizontal realizado para S. frugiperda y S. zeamais, ahí los aislados de Bt en función de la composición química del medio de reproducción, en especial el CST, ahí generaron los complejos esporas/cristales tóxicos contra estos dos IP, a pesar de pertenecer a órdenes de insectos: lepidóptera y coleóptera, lo que apoyo la identificación de una subespecie de Bt diferente a la reportada para ambientes de almacén de granos como la var. kurstaki y/o las fábricas de alimentos de ganado y aves como la var. Morrisoni (Rowe et al. 1987, Martin & Travers 1989, Lambert & Peferoen 1992, Meadows et al. 1992). Finalmente comportamiento bioquímico de algunos de estos aislados fue similar al de la subespecie morrisoni de Bt. Mientras la otra fue análoga a la ampliamente distribuida en la naturaleza conocida como kurstaki (datos no mostrados) (Audtho et al. 1999, De Amorin et al. 2001, Guerchicoff et al. 2001).

Por otro lado, los resultados de este trabajo sugieren que es necesario investigar sobre la síntesis de esporas-cristales de los nuevos aislados de Bt recuperados de diversas fuentes como los granos y sus residuos en almacén, tanto en medios de cultivo artificiales como naturales (Klanfon & De Barjac 1985, Sayyed et al. 2000, Dumalge 1990). Dado que 3 aislados de Bt de la subespecie israelensis reproducidos en 6 medios de cultivo en concentraciones variables de azúcares y proteínas genero la síntesis de esporas y cristales con diferente grado de toxicidad para mosquitos (Rowe et al. 1987, Georghiou 1990, Dumalge et al. 1990).

La viabilidad de las esporas de ambos aislados de Bt fue mayor en el almacén y restringida cuando Z. mays se expuso al ambiente abierto (Sánchez-Yáñez & Peña-Cabriales 2000, Pinnock et al. 1974), la literatura al respecto indica que la muerte de las esporas fue causada por la acción germinada de la luz solar, asociada con la carencia de las pequeñas proteínas solubles en el ácido (PPSA) que forman parte de la cubierta de las esporas de Bt; estas PPSA proporcionan a las esporas tolerancia a la radiación solar (Ignoffo & Garcia 1978, Benoit et al. 1990, Griego & Spence 1978). Con base en lo anterior se justifica porque a nivel de campo en el eficaz control de un especifico IP; el complejo espora cristal deberá aplicarse exclusivamente cuando la mayor por ciento de los huevecillos del IP estén eclosionando, y darle un tiempo suficiente de consumo del material foliar con el complejo espora/cristal de Bt; principalmente durante las primeras horas del día y/o por la tarde cuando la radiación solar es menor que al mediodía (Lambert & Perefon 1992), cuando la exposición del complejo espora/cristal a esa radiación destruye y desnaturalizan ambos (Sánchez-Yáñez & Peña-Cabriales 2000, Ignoffo & Garcia 1978). Lo anterior justifica el empleo de complejos espora/cristal encapsulados de Bt, que aumentan la eficacia del control biológico de IP agrícola, forestales y urbanos (Rowe et al. 1987, Rausell et al. 2000, Schnepf et al. 1998).

Con base a los resultados obtenidos en esta investigación se apoya que en  almacén de granos independientemente del tipo, origen y en especial  de la ausencia de luz, con mínima de humedad y baja actividad depredatoria de microorganismos que eliminen las esporas de Bt; se favorece la existencia y supervivencia de más de una variedad de Bt. La supervivencia de las posibles subespecies de las esporas de Bt en los granos de Z. mays, fue directamente dependiente de su exposición a la radiación solar, en contraste con la persistencia relativamente prolongada en los granos Z. mays almacenados. Estos resultados que apoyan innovadoras formas de aplicación de los complejos esporas/cristales de Bt, que toleran efectos letales de la radiación solar para mejorar la eficacia del control biológico de IP en el campo, en el bosque y en la ciudad que eviten la proliferación de insectos vectores transmisores de enfermedades como el dengue, el paludismo y el chikungunya; en lugar de los convencionales y contaminantes plaguicidas químicos de riesgo para la salud humana.

 

Conflictos de intereses 

Esta investigación no tiene conflictos de interés en relación con quien la realizo y apoyó.

 

Agradecimientos

Al proyecto 2.7 (2016) de la CIC de la UMSNH. Al Instituto de Investigaciones Metalúrgicas-UMSNH por las facilidades del microscópico de ba­rrido y su técnico Francisco Solario. A Beatriz Noriega-Gam-boa por su paciencia en la elaboración de las figuras. A BIONUTRA, S.A. de CV, Maravatio, Mich, México.

 

Literatura citada

Amador RAL, Boschini FC. Fenología productiva y nutricional de maíz para la producción de forrage. Agron Mesoam. 2000; 11(1): 171-7.         [ Links ]

Audtho M, Valaitis AP, Alzate O, Dean DH. Production of chymotrypsin-resistant Bacillus thuringiensis Cry2Aa1 δ-endotoxin by protein engineering. Appl Environ Microbiol. 1999; 65 (10): 4601-5.         [ Links ]

Benoit TG, Wilson GR, Bull DL, Aronson AI. Plasmid-associated sensitivity of Bacillus thuringiensis to UV light. Appl Environ Microbiol. 1990; 56(8): 2282-6.         [ Links ]

De Amorim GV, Whittome B, Shore B, Levin DB. Identification of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki strain HD1-like bacteria from environmental and human samples after aerial spraying of Victoria, British Columbia, Canada, with Foray 48B. Appl Environ Microbiol. 2001; 67(3): 1035-43.         [ Links ]

De Maagd RA, Weemen-Hendriks M, Stiekema W, Bosch D. Bacillus thuringiensis delta-endo to xin Cry1C domain III can function as a specificity determinant for Spodoptera exigua in different, but not all, Cry1-Cry1C hybrids. Appl Environ Microbiol. 2000; 66:1559-63.         [ Links ]

Dulmage HT, Correa JA, Gallegos-Morales G. Potential for improved formulations of Bacillus thuingiensis israelensis through standardization and fermentation development. 199O. p. 110-133. /n.' H. de Barjac and D. J. Sutherland (eds.). Bacterial control of mosquitoes and black flies. Rutgers Univ. Press, New Brunswick, NJ.

Dulmage HT. Production of the spore-δ-endotoxin complex by variants of Bacillus thuringiensis in two fermentation media. J Invertebr Pathol. 1970; 16(3): 385-9.         [ Links ]

Georghiou GP. Overview of insecticide resistance. ACS Symposium series. American Chemical Society (USA); 1990. p. 18-41.

Griego VM, Spence KD. Inactivation of Bacillus thuringiensis spores by ultraviolet and visible light. Appl Environ Microbiol. 1978; 35(5): 906-10.         [ Links ]

Guerchicoff A, Delécluse A, Rubinstein CP. The Bacillus thuringiensis cyt genes for hemolytic endotoxins constitute a gene family. Appl Environ Microbiol. 2001; 67(3): 1090-6.         [ Links ]

Herrero S, Ferré J, Escriche B. Mannose Phosphate Isomerase Isoenzymes in Plutella xylostella Support Common Genetic Bases of Resistance to Bacillus thuringiensis Toxins in Lepidopteran Species. Appl Environ Microbiol. 2001a; 67(2): 979-81.         [ Links ]

Herrero S, Oppert B, Ferré J. Different Mechanisms of Resistance to Bacillus thuringiensis Toxins in the Indian meal Moth. Appl Environ Microbiol. 2001b; 67(3): 1085-89.         [ Links ]

Hua G, Masson L, Jurat-Fuentes JL, Schwab G, Adang MJ. Binding analyses of Bacillus thuringiensis Cry δ-endotoxins using brush border membrane vesicles of Ostrinia nubilalis. Appl Environ Microbiol. 2001; 67(2): 872-9.         [ Links ]

Ignoffo CM, Garcia C. UV-photoinactivation of cells and spores of Bacillus thuringiensis and effects of peroxidase on inactivation. Environ Entomol. 1978; 7(2): 270-2.         [ Links ]

Itoua-Apoyolo C, Drif L, Vassal JM, Debarjac H, Bossy JP, Leclant F, et al. Isolation of Multiple Subspecies of Bacillus thuringiensis from a Population of the European Sunflower Moth, Homoeosoma nebulella. Appl Environ Microbiol. 1995; 61(12): 4343-7.         [ Links ]

Kaelin P, Morel P, Gadani F. Isolation of Bacillus thuringiensis from stored tobacco and Lasioderma serricorne (F.). Appl Environ Microbiol. 1994; 60(1): 19-25.         [ Links ]

Kieser T. Factors affecting the isolation of CCC DNA from Streptomyces lividans and Escherichia coli. Plasmid. 1984; 12(1): 19-36.         [ Links ]

Kiselek EV. Survival of bacterial entomopathogens in tree crowns and in soil around the trunk. Vestn Selskokhoz Nauki (Moscow). 1974; 5: 68-71.         [ Links ]

Klanfon AR, De Barjac H. Screening of the insecticidal activity of Bacillus thuringiensis strains against the Egyptian cotton leaf worm Spodoptera littoralis. Entomophaga. 1985; 30(2): 177-86.         [ Links ]

Lambert B, Peferoen M. Insecticidal promise of Bacillus thuringiensis. Facts and mysteries about a successful biopesticide. BioScience. 1992; 42(2): 112-22.         [ Links ]

Lightwood DJ, Ellar DJ, Jarrett P. Role of Proteolysis in Determining Potency of Bacillus thuringiensis Cry1Ac δ-Endotoxin. Appl Environ Microbiol. 2000; 66(12): 5174-81.         [ Links ]

Luna-Olvera H, Peña-Cabriales J. Ecología de Bacillus thuringiensis. En Avances Recientes en la Biotecnología en Bacillus thuringiensis. Editores LJ Galán-Wong et al.1993. Universidad Autonóma de Nuevo León, Monterrey, N.L. México 1993: 179-85.

Martin PA, Travers RS. Worldwide abundance and distribution of Bacillus thuringiensis isolates. Appl Environ Microbiol. 1989; 55(10): 2437-42.         [ Links ]

Meadows MP, Ellis DJ, Butt J, Jarrett P, Burges HD. Distribution, frequency, and diversity of Bacillus thuringiensis in an animal feed mill. Appl Environ Microbiol. 1992; 58(4): 1344-50.         [ Links ]

Moir A, Smith DA. The genetics of bacterial spore germination. Annu Rev Microbiol. 1990; 44(1): 531-53.         [ Links ]

Pinnock DE, Brand RJ, Jackson KJ, Milstead JE. The field persistence of Bacillus thuringiensis spores. J Invertebr Pathol. 1974; 23(3): 341-6.         [ Links ]

Rausell C, Martinez-Ramirez AC, García-Robles I, Real, MD. A binding site for Bacillus thuringiensis Cry1Ab toxin is lost during larval development in two forest pests. Appl Environ Microbiol. 2000; 66(4): 1553-8.         [ Links ]

Rowe OE, Margaritis A, Dumalge HT. Bioprocess developments in the production of bioinsecticides by Bacillus thuringiensis. Crit Rev Biotechnol. 1987; 6(1): 87-127.         [ Links ]

Sánchez-Yáñez J. Breve Tratado de Microbiología Agrícola Teoría y Práctica. Instituto de Investigaciones Químico Biológicas, Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, COSUSTENTA, SA de CV, Centro de Investigación y Desarrollo del Estado de Michoacán, Morelia, Mich México. 2007: 130-3.

Sánchez-Yáñez JM, Peña-Cabriales J. Persistencia de esporas de Bacillus thuringiensis en hojas de maíz, de frijol y en el suelo. Terra Latinoam. 2000; 18(4): 325-31.         [ Links ]

Sayyed AH, Haward R, Herrero S, Ferré J, Wright DJ. Genetic and Biochemical Approach for Characterization of Resistance to Bacillus thuringiensis Toxin Cry1Ac in a Field Population of the Diamondback Moth, Plutella xylostella. Appl Environ Microbiol. 2000; 66(4): 1509-16.         [ Links ]

Schnepf E, Crickmore N, Van Rie J, Lereclus D, Baum J, Feitelson J, et al. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol Mol Biol Rev. 1998; 62(3): 775-806.         [ Links ]

Smith RA, Couche GA. The phylloplane as a source of Bacillus thuringiensis variants. Appl Environ Microbiol. 1991; 57(1): 311-5.         [ Links ]

Tabashnik BE, Liu YB, de Maagd RA, Dennehy TJ. Cross-resistance of pink bollworm (Pectinophora gossypiella) to Bacillus thuringiensis toxins. Appl Environ Microbiol. 2000; 66(10): 4582-4.         [ Links ]

Wirth MC, Delécluse A, Walton WE. Lack of cross-resistance to Cry19A from Bacillus thuringiensis subsp. jegathesan in Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) resistant to Cry toxins from Bacillus thuringiensis subsp. israelensis. Appl Environ Microbiol. 2001; 67(4): 1956-18.         [ Links ]

______________