https://doi.org/10.36610/j.jsars.2021.12010030

Nota de Investigación

 

Rhizobium phaseoli tolerante a un insecticida en el crecimiento de Phaseolus vulgaris

 

Rhizobium phaseoli tolerant to insecticide on the growth of Phaseolus vulgaris

 

 

Santoyo-Pizano Gustavo¹, Hernández-Mendoza José Luis², Márquez-Benavides Liliana¹, De Luna-Esquivel Gustavo³, Sánchez-Yáñez Juan Manuel^1*

¹Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. Instituto de Investigaciones Químico Biológicas. Laboratorio de Microbiología Ambiental. Edif. B-3, Ciudad Universitaria. Francisco J. Mujica S/N Felicitas del Rio. C.P. 58000. Morelia. Michoacán, México. Tel: +0052 44 33 22 3500 ext. 4240
²Instituto Politécnico Nacional. Centro de Biotecnología Genómica. Boulevard del Maestro S/N esq. Elías Piña. Col. Narciso Mendoza, CP. 88710 Cd. Reynosa, Tamaulipas. México Tel: +52(55) 5729 6000
³Universidad Autónoma Chapingo. Departamento de Preparatoria Agrícola. Km. 38.5 Carretera Federal México-Texcoco. Chapingo, Estado de México. C.P. 56230. Tel: 01595 95 21677.

*Dirección de contacto: Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. Instituto de Investigaciones Químico Biológicas. Laboratorio de Microbiología Ambiental. Edif. B-3, Ciudad Universitaria. Francisco J. Mujica S/N Felicitas del Rio. C.P. 58000. Morelia. Michoacán, México. Tel: +0052 44 33 22 3500 ext. 4240

Sánchez-Yáñez Juan Manuel
E-mail address : syanez@umich.mx

J. Selva Andina Res. Soc. 2021; 12(1):30-37.

ID del artículo: 146/JSARS/2020

Historial del artículo.
Recibido julio 2020.
Devuelto noviembre 2020.
Aceptado diciembre 2020.
Disponible en línea, febrero 2021.

 

 

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Resumen

El género y especie Rhizobium phaseoli es usado como inoculante en la producción de Phaseolus vulgaris (fríjol), porque en los nódulos de sus raíces, establece una simbiosis para fijar el nitrógeno molecular (FBN) y suplir la demanda de nitrógeno (N) para un crecimiento sano. En el cultivo de P. vulgaris se aplican plaguicidas en el control de insectos plaga de raíz, que evitan el efecto benéfico de R. phaseoli., por lo que los objetivos de este trabajo fueron aislar y seleccionar R. phaseoli tolerante a diazinón. Para ello, R. phaseoli se creció en caldo extracto levadura manitol con diazinón y selecciono R. phaseoli tolerante al insecticida e inoculó en P. vulgaris para determinar la infectividad con base en el número de nódulos, mientras que la efectividad para la FBN en la raíz, de acuerdo al incremento en el peso fresco y seco, en la altura de la planta, y en la capacidad para degradar el diazinón. Se concluye que el R. phaseoli tolerante a diazinón fue infectivo y efectivo para el sano crecimiento de P. vulgaris.

Palabras clave: Suelo, R. phaseoli, P. vulgaris, simbiosis, fijación biológica N₂, insecticidas, insectos-plaga.

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Abstract

The genus and species of Rhizobium phaseoli are useful as an inoculant for the production of Phaseolus vulgaris (beans) in the root nodules symbiotic stage fixes molecular nitrogen (FN) for supplying nitrogen (N) for healthy growth. In P. vulgaris cropping, pesticides are used to control root insects, which could reduce the beneficial effect of R. phaseoli. The purpose of this work was to isolate and select R. phaseoli diazinon´s tolerance. In that sense, R. phaseoli were cultivated in a medium mixed with diazinon in order to select R. phaseoli tolerant to the pesticide. This mutant of R. phaseoli tolerant to diazinon was inoculated in P. vulgaris the effect was evaluated 45 days later. The response of P. vulgaris was measured by the number of effective nodules at the roots, fresh and dry weight, and the height of the plant.  Results showed that R. phaseoli tolerant to diazinon kept its beneficial activity for the healthy growth of P. vulgaris. It was concluded that R. phaseoli tolerant to diazinon were infective and effective for the health growth of P. vulgaris.

Keywords: Soil, R. phaseoli, P. vulgaris, symbiosis, biological N₂ fixing, insecticides, insect-pest.

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Introducción

La simbiosis entre las leguminosas y Rhizobium, es fundamental en la agricultura por el impacto positivo que tiene en el cultivo y consumo de Phaseolus vulgaris y de otras leguminosas¹. El inocular semilla de P. vulgaris con R. phaseoli evita la hiperfertilización nitrogenada al suelo, además de que asegura el sano crecimiento y rendimiento rentable de P. vulgaris¹ cuyo grano es considerado como uno de los principales en México, en principio por el alto consumo y producción, de ahí la importancia económica².

Uno de los problemas para asegurar un sano crecimiento de P. vulgaris, es el control de insectos-plaga que dañan la raíz, con lo que evitan la acción benéfica de Rhizobium phaseoli³, primero para ejercer la infectividad o formación de nódulos y la efectividad o la capacidad de R. phaseoli para suplir adecuadamente la demanda de nitrógeno (N) para un sano crecimiento. En consecuencia, se aplican plaguicidas que en lo general inhiben o aniquilan a R. phaseoli, sin embargo, la información al respecto es contradictoria, pues se reporta que el crecimiento de R. phaseoli se inhibe con mínimas concentraciones de dicloro difenil tricloroetano (DDT) y folidol, siendo incluso menores a los que se recomiendan en el campo en el control de insectos-plaga de raíces de P. vulgaris. Mientras que otros señalan que Rhizobium spp., puede ser tolerantes a plaguicidas sin perder la capacidad infectiva y efectiva^4,5. Así se ha reportado que la nodulación en el sistema radical de P. vulgaris por R. phaseoli se anula o reduce a causa de la toxicidad de estos plaguicidas^6,7, lo que disminuye la efectividad o efecto positivo para el sano crecimiento de P. vulgaris, en principio porque inactivan la nitrogenasa para fijar nitrógeno molecular (N₂) o FBN^8,9. Con base en lo anterior los objetivos de este trabajo fueron seleccionar y analizar R. phaseoli tolerante a diazinón para el sano crecimiento de P. vulgaris.

 

Materiales y métodos

Origen de las cepas de R. phaseoli. Se recuperaron de las raíces de Phaseolus var Bayo, en agar extracto de levadura manitol rojo Congo (AELMRC) con la siguiente composición (g/L): K₂HPO₄ 0.5, M_gSO₄ 0.2, NaCl 0.1, manitol 1.0, extracto de levadura 1.0, rojo Congo 10.0 mL/L (de una solución 1:500), agar-agar 20.0 g, agua destilada 1000.0 mL, pH 7.0 de acuerdo con Vincent¹⁰, colectados del campo agrícola experimental del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), Aldama, Tamaulipas, México, se designaron con las claves: ReD, ReDa y ReD1, hoy son parte de la colección del laboratorio de Microbiología Ambiental del Instituto de Investigaciones Químico Biológicas (IIQB)-Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo (UMSNH)^1,10.

Selección de R. phaseoli tolerante a diazinón. En este ensayo se probaron plaguicidas de frecuente aplicación en Aldama Tamaulipas, México, como: el diazinón (O,O-dietil O-2-isopropil-6-metilpiri-midin-4-il fosforotioato) - Servin (1-naphthyl N-methyl carbamate), c/pesticida se agregó al AEL-MRC en concentración de: 250, 300, 500 y 100 ppm, para lo cual en un matraz nefelométrico, se inoculo 1.0 mL equivalente a 1 x 10⁶ UFC/mL de R. phaseoli por 100 mL de caldo extracto levadura manitol (CELM) más el diazinón o el Servin en concentración de: 200, 300, 400 y 1000 ppm, estos matraces se incubaron por 24 a 36 h en agitación/200 rpm, para la adaptación y selección de R. phaseoli a la concentración creciente de diazinón y Servin. La adaptación de R. phaseoli al incremento de la concentración de cada plaguicida se logró al detectar el crecimiento esperado con ese aumento, comparado con el crecimiento normal de R. phaseoli en el matraz nefelométrico en CELM sin el diazinón o el Servin en las mismas condiciones de incubación, temperatura y tiempo⁴.

Prueba de infectividad y efectividad de R. phaseoli resistente a diazinón en P. vulgaris. Seleccionadas las cepas de R. phaseoli tolerantes a diazinón, (puesto que el Servin inhibió el crecimiento de R. phaseoli desde la primera concentración por lo que ya no se usó).

Figura 1 Jarra de Leonard⁵

Por lo que entonces las semillas de P. vulgaris var Bayo (donadas por la Secretaria de Agricultura Ganadería Pesca Desarrollo Rural y Alimentación del gobierno de México) se inocularon con el R. phaseoli resistente a diazinón en las jarras de Leonard (figura 1) ahí el suelo se colocó en la parte superior de la jarra de Leonard y la solución mineral o el agua en la parte inferior de la jarra, ambas partes se conectaron con una tira de algodón de 20 cm de largo, para movimiento del líquido por capilaridad⁵, el suelo donde se le sembró el P. vulgaris tenía las siguientes propiedades fisicoquímicas: fue un laterítico con pH 6.64, textura arcilla 40.56 %, arena 0.76 %, limo 37.8 %, capacidad de campo 30.08 %, humedad materia orgánica 4.57 %, pobre en nitrógeno total 0.1 %, capacidad de campo 30.08 %, y capacidad de intercambio catiónico de 4.61 mg/100 g. Este suelo se tamizó con malla de No. 20 se solarizó 48 h a 70 °C, para evitar plagas y enfermedades, las jarras de Leonard se colocaron en el invernadero bajo las siguientes condiciones micro climáticas promedio fueron: la temperatura de 23.2 °C, con una luminosidad de 450 µmol•m^-2•s^-1 y una humedad relativa de 67 %. P. vulgare con R. phaseoli se alimentó con una solución mineral con la siguiente composición química: 1 molar de K₂HPO₄, KH₂PO₄, CaCl₂, M_gSO₄, trazas de FeSO_4, 1.0 mL de solución de elementos menores en 1000 mL de agua destilada ajustada a pH 7 que se pasteurizó (90 °C/10 min). Posteriormente 45 días después se evaluó el efecto de las cepas de R. phaseoli tolerante a diazinón en P. vulgaris mediante las siguientes variables-respuesta, la altura de la planta (AP), diámetro de la hoja (DH) (cm), así como el peso seco del follaje (PSF), número de nódulos efectivos en la raíz el peso seco y el peso seco de la raíz¹⁰.

Evidencia de que R. phaseoli degradó (coometabolismo) el diazinón en medio de cultivo. Las cepas de R phaseoli tolerantes a diazinón se inocularon en un matraz nefelométrico, con caldo extracto levadura manitol rojo Congo (CELMRC) con diazinón, los matraces se agitaron por 300 rpm hasta la fase estacionaria, mediante una cuenta viable que se alcanzó a las 30 h de incubación de acuerdo a la curva de crecimiento de R. phaseoli, en comparación con el mismo R. phaseoli en CELMRC sin diazinón. Con este ensayo se evidencio el coometabolismo de R. phaseoli para degradar el diazinón en combinación con el manitol usado como fuente de carbono ^4,11-13.

 

Resultados

En la tabla 1 se muestra el efecto de las cepas de R. phaseoli tolerantes a diazinón en el crecimiento de P. vulgaris en función del número de nódulos efectivos que determinan una condición de salud vegetal con 19, 20, 39 generados respectivamente por las cepas de R. phaseoli resistentes a diazinón denominadas ReD, ReDa y ReD1. En relación al color de las hojas de P. vulgaris fueron indicadoras de que las cepas infectaron las raíces de P. vulgaris con nódulos de color rojo (efectivos), lo que indica la presencia de leghemoglobina asociada con la capacidad de fijar N₂ y el color verde e intenso en las hojas¹.

Tabla 1 Efecto de Rhizobium phaseoli tolerante a diazinón en el crecimiento de Phaseolus vulgaris, var Bayo

1n=20 *letras iguales sin diferencia estadística según Tukey (p<0.05).

En la tabla 2, donde de acuerdo a la literatura se observó que las cepas de R. phaseoli de ReD, ReDa y ReD1 tolerantes a diazinón tuvieron un efecto positivo en el DH, la AP de P. vulgaris con 19.1, 24.9, 18 cm, así como en el PSF, estos valores numéricos fueron, estadísticamente diferentes en comparación con las cepas de R. phaseoli silvestres u originales incapaces de crecer en presencia del diazinón. Al igual que las cepas P. phaseoli tolerantes a diazinón en el número de nódulos efectivos rojos, el peso seco que incluyo el de la raíz completa, sin diferencia estadística comparado con los valores numéricos análogos registrados en P. vulgaris con P. phaseoli silvestre u original no tolerantes al diazinón.

Tabla 2 Comparación de la infectividad y efectividad de Rhizobium phaseoli silvestre y R. phaseoli tolerante a diazinón en el crecimiento de Phaseolus vulgaris var Bayo

1n=20 *Letras iguales sin diferencia estadística significativa (0<0.5) según Tukey.

En la tabla 3 se muestra que las cepas de R. phaseoli crecidas en AELMRC con diazinón generaron un número de unidades formadoras de colonias (UFC) con un valor numérico estadísticamente diferente comparado con las cepas de R. phaseoli silvestre (originales) en AELMRC sin diazinón, lo que indica que las cepas sometidas a la máxima concentración de diazinón se adaptaron fisiológicamente, al insecticida, aunque hubo una reducción en el UFC R. phaseoli, puesto que se trata de una selección natural lo que causó la muerte de las células de R. phaseoli que susceptibles a la toxicidad del diazinón⁴.

Tabla 3 Comparación de la estabilidad de la resistencia de mutantes de Rhizobium phaseoli a diazinón en relación con Rhizobium phaseoli silvestre

1*promedio de 4 repeticiones en las UFC=Unidades formadoras de colonias x102/mL *AELMRC=Agar extracto levadura manitol rojo Congo.  **Letras iguales sin diferencia significativa (<0.05) según Tukey.

En la tabla 4 se muestra el crecimiento como UFC, registrado en las cepas de R. phaseoli tolerantes a diazinón, la literatura señala que puede ser por una acción de coometabolismo cuando usan el manitol para la degradación del diazinón, en esta tabla fue evidente que cuando R. phaseoli creció en manitol y diazinón se registró un decremento de la cantidad de colonias como UFC, porque aunque R. phaseoli lo degradan fue toxico para una parte de la población total de R. phaseoli, en comparación cuando creció en el AELMRC sin diazinón, que representa la cantidad del crecimiento en UFC esperado, mientras que al suprimir el manitol como el diazinón, la ausencia de ambas causo un drástico disminución de la población de R. phaseoli, porque los otros componente del AELMRC: como el extracto de levadura y rojo Congo fueron insuficientes para que R. phaseoli, pudiese reproducirse al nivel que registró cuando el medio de cultivo contenía el manitol como única fuente de carbono y energia¹.

Tabla 4 Coometabolismo de diazinón por cepas de Rhizobium phaseoli tolerantes al insecticida en comparación con el crecimiento sin el insecticida

1UFC (Unidades formadoras de colonias/mL). *Letras iguales sin diferencia estadística significativa (<0.05) Según Tukey. 2AELMRC=agar extracto levadura manitol rojo Congo.

 

Discusión

En la tabla 1 se muestra que se observó una respuesta positiva de P. vulgaris con base en el número de nódulos efectivos, que apoyan que R. phaseoli tolerantes a diazinón conservaron los plásmidos que contienen la infectividad y efectividad en las raíces de P. vulgaris, para un sano crecimiento, porque en el suelo había insuficiente nitrógeno mineral para el crecimiento de P. vulgaris^1,5,6,12.

En la tabla 2, se muestra que las cepas de R. phaseoli tolerantes a diazinón conservaron los plásmidos responsables de la nodulación o infectividad, que eran de color rojo lo que indico la presencia de leghe-moglobina, proteína relacionada con la capacidad de fijar N₂ (efectividad), en consecuencia P. vulgaris sintetizo suficiente clorofila, para el color verde intenso de las hojas un característica fenológica de un sano crecimiento cuando P. vulgaris esta simbiosis con cepas de R. phaseoli que sean infectivas y efectivas^7,10,13.

Tabla 3 se presenta la evidencia de que el crecimiento de R. phaseoli en agar extracto levadura manitol (AELM) con diazinón con base en las UFC, fue el resultado de una selección natural de la adaptación fisiológica al diazinón, sin el riesgo de perder la capacidad de crecer en presencia del diazinón, el valor de numérico de las UFC, se redujo en relación con la misma variable de UFC, de las cepas silvestres de R. phaseoli, pues durante la de selección una parte de esta población susceptible al diazinón murió, por el ello el número de UFC de R. phaseoli tolerante al diazinón fue menor^14-16. Al igual que se ha reportado para otros géneros especies de la familia Rhizobiaceae como Bradyrhizobium spp, que también coometabolizan y/o mineralizan otros plaguicidas aplicados, en la agricultura convencional en el control de insectos-plaga que atacan las raíces de leguminosas^15,16. La capacidad para degradar insecticidas similares al diazinón, es una propiedad bioquímica común en la naturaleza según los reportado para otros grupos bacterianos distintos a R. phaseoli como: Pseudomonas, Streptomyces, Micromonospora, Thermoactinomyces, Nocardia y Mycobacteri-um^4,12,13 al igual que géneros y especies de hongos del suelo, y/o de aquellos viven en asociación con las raíces vegetales del tipo: Aspergillus fumigatus, Cunninghamella elegans¹⁷, Penicillium citreonigrum¹⁸. Rhizopus nodosus, incluye a las enterobacterias patógenas humanas: Escherichia coli, Salmonella bongori que son capaces de mineralizan el diazinón, lo anterior apoya esto se debe a que tanto eucariotas con procariotas, tienen esta propiedad genética de resistencia a diazinón, porque tienen relación con las actividades humanas de manejo de plantas y aguas que son parte de la agricultura^19-21.

Tabla 4 se muestra la tolerancia de R. phaseoli al diazinón fue el resultado de la capacidad de adaptación fisiológica de este género y especie, que además tiene en el genoma codificada la utilización de compuestos de carbono similares al diazinón, por lo que si existe otra fuente de carbono sencilla que al oxidarse facilite la degradación del plaguicida, una acción bioquímica conocida como coometabolismo. Lo que se demostró cuando R. phaseoli tolerante al diazinón creció en el AELM y el diazinón, en comparación con la inhibición del crecimiento de R. phaseoli en AEL sin manitol ni diazinón^4,8,11,14. La selección de cepas de R. phaseoli resistentes a plaguicidas útiles en la agricultura convencional, se reporta en cepas Bradyrhizobium japonicum para el cultivo de Glycine max para evitar el ataque de insectos plaga^15,22,23. Por ello R. phaseoli se recomienda en zonas agrícolas donde P. vulgaris tiene problema con los insectos-plagas que destruyen la raíz y limitan el sano crecimiento, en especial porque el diazinón se emplea durante el cultivo de P. vulgaris en dosis similares a las evaluadas en esta investigación¹², puesto que el diazinón se aplica en las fases iniciales de crecimiento de P. vulgaris sin evidencia de que persista en las vainas y/o semillas de P. vulgaris¹⁴. Con base a lo anterior se concluye que es posible obtener cepas de R. phaseoli tolerantes a diazinón altamente infectivas y efectivas para un sano crecimiento de P. vulgaris sin riesgo de pérdidas provocadas por insectos plaga que atacan el sistema radical.

 

Fuente de financiamiento y agradecimientos

Al Proyecto 2.7 (2021) de la CIC-UMSNH, BIONUTRA SA de CV de Maravatío, Michoacán, México, a Jeanneth Caicedo Rengifo en la escritura, a: EDI, COFAA- IPN y SNI por el apoyo.

 

Conflictos de intereses

Los autores de este artículo, declaramos que no existe ningún conflicto de interés en la planificación, ejecución y redacción de la investigación realizada, como tampoco con aquellas personas e instituciones que la financiaron.

 

Consideraciones éticas

La aprobación de la investigación por el Comité de Ética de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, México siguió las pautas establecidas por ese comité.

 

Aporte de los autores en el artículo

Santoyo Pizano Gustavo, planeación del experimento y análisis estadístico de todos los resultados. Hernández Mendoza José Luis, actualización de la literatura y revisión parcial de literatura para los resultados experimentales. Márquez-Benavides Liliana, análisis de resultados y critica de la discusión de resultados. De Luna-Esquivel Gustavo, apoyo para el diseño experimental y ejecución de experimentos con Phaseolus vulgars y Rhizobium phaseoli. Sánchez-Yáñez Juan Manuel, Planeación, dirección de los experimentos, análisis integral de resultados, redacción del artículo, responsable del apoyo financiero de la investigación.

 

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Nota del Editor:

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