Introducción

Actualmente el sano crecimiento de Triticum aestivum, es importante por el consumo en México y el mundo^1,2, para lo cual se utilizan elevadas dosis de fertilizante nitrogenado (FN) comúnmente en forma de NH₄NO₃ (nitrato de amonio), el que en el suelo provoca una rápida mineralización de la materia orgánica (MO), con subsecuentemente disminución de las principales propiedades asociadas a la productividad agricola³. Una alternativa de solución para racionalizar y optimizar el FN en T. aestivum, es inocular las semillas con géneros y especies de bacterias endófitas promotoras de crecimiento vegetal (BEPCV) que aceleran la germinación^4,5, colonizan el interior de las raíces e inducen la formación de un sistema radical denso que optimiza el FN, mediante una rápida y eficaz absorción, que permite el crecimiento saludable, a través de la conversión de los compuestos orgánicos de T. aestivum (generados por la semilla al germinar) por Azotobacter vinelandii y Bacillus subtilis, en sustancias promotoras de crecimiento vegetal (SPCV) o fitohormonas las responsables que en las raíces aumenten la capacidad de absorción del FN y optimizarlo, cuando la dosis se restringe en relación a la dosis recomendada^6,7.

En la literatura se reportan un amplio grupo de géneros y especies de bacterias promotoras de crecimiento vegetal (BPCV) que colonizan en rizoplano-rizosfera de las gramíneas domesticas como T. aestivum^8,9, relacionadas con A. vinelandii y B. subtilis del tipo: Azospirillum lipoferum, A. brasilense¹⁰, Klebsiella sp.⁸, Paenibacillus¹¹, Clostridium¹², así como Pseudomonas¹³, que en semillas de T. aestivum pueden ser benéficas mediante diferentes estrategias: i) la fijación biológica del nitrógeno atmosférico (N₂) en suelo pobre en N orgánico o mineral^14,15, ii) por la síntesis de fitohormonas a partir de compuestos orgánicos como azucares sencillos, ácidos orgánicos, aminoácidos del metabolismo vegetal de la semilla y de las raíces por estos géneros y especies bacterianas inducen una raíz densa¹⁶ con mayor capacidad de absorción del FN al 50 %, iii) mediante la síntesis de fosfatasas para la solubilización de PO₄³⁻ (fosfatos) ambos nutrientes N como PO₄³⁻ son limitantes del sano crecimiento de T. aestivum. Mientras que otro problema común es, que tales géneros de BPCV son específicas y benéficas solo para ciertas variedades de T. aestivum, lo que se podría solucionar con la selección y aplicación de géneros y especies con un amplio patrón de interacción vegetal con gramíneas domesticas tal el caso de: A. vinelandii y/o B. subtilis que aisladas del interior de Zea mays var. mexicana o teocintle (uno de los principales ancestros de Zea mays doméstico), es capaz de crecer en suelo pobre en MO, en minerales esenciales para las plantas como el nitrógeno (N), el P (fósforo) y K (potasio). No obstante, teocintle crece sanamente a pesar del estrés nutricional y/o por sequía, además el teocintle es tolerantes a agentes fitopatógenos aéreos como radicales^17,18. En general en el ambiente como el suelo, las condiciones físicas, químicas y biológicas son las que permiten al teocintle para establecer asociaciones con microorganismos endófitos, por lo que en ese sentido, A. vinelandii y B. subtilis recuperadas del interior del teocintle, tienen potencial en invadir las raíces de T. aestivum en optimizar al máximo el FN reducido hasta un 50 %, en comparación con los géneros y especies de BPCV aislados y probados en gramíneas domésticas como a T. aestivum, con base en lo anterior se supone que A. vinelandii y B. subtilis podrían transformar los compuestos orgánicos de la semilla y raíz de T. aestivum para crecimiento saludable, a pesar de restringir la dosis del FN recomendado¹⁹. El objetivo de esta investigación fue analizar el crecimiento de T. aestivum inoculado con A. vinelandii y B. subtilis con el FN al 50 %.

Materiales y métodos

Esta investigación se realizó en el Laboratorio de Microbiología Ambiental del Instituto de Investigaciones Químico-Biológicas de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, las condiciones micro climáticas promedio fueron: temperatura de 23.2 °C, luminosidad de 450 μmol・m^-2s^-1, humedad relativa de 67 %.

Origen de los géneros y especies endófitas de bacterias promotoras de crecimiento vegetal. A. vinelandii y B. subtilis se aislaron del interior de raíces de Zea mays var. mexicana (teocintle), colectada de suelo franco-arcillosos pobre en MO, en minerales de N, en PO₄ ^3- solubles, con pH 6.8, de los municipios Santa Ana Maya y Álvaro Obregón ubicados en el noreste del estado de Michoacán en el 35 km al noreste de Morelia, Mich, México.

Figura 1 Diagrama de jarra de Leonard²⁰ 

Inoculación de T. aestivum con A. vinelandii y B. subtilis endófitas de teocintle con el fertilizante nitrogenado al 50 %, en invernadero. La semilla de T. aestivum var. Pavón fueron donadas por la secretaria de Agricultura del gobierno de México, las que se desinfectaron primero con NaClO al 0.2 %/5 min, se lavaron 6 veces con agua potable estéril, después con alcohol al 70 % (v/v) /5 min, se lavaron 6 veces con agua potable estéril, posteriormente A. vinelandii se reprodujo en caldo Burk, (g/L): glucosa 5.0 g, KH₂PO₄ 0.16 g, K₂PO₄ 0.64 g, NaCl 0.2 g, MgSO₄. 7H₂O 0.2 g, CaSO₄. 2H₂O 0.05 g, NaMoO₄. 2H₂O 0.01 g, FeSO₄ 0.003 g, agua destilada 1000 mL, pH 6.8, mientras que B. subtilis en caldo nutritivo (g/L): extracto de carne 8.0 g, peptona 5.0 g, pH 7.0, agua destilada 1000 mL, ambos géneros bacterianos se incubaron por 28 °C/35 h entonces, 5 g de semillas de T. aestivum se inocularon con 1x10⁶ UFC/mL/semilla: calculado por cuenta viable en placa en agar nutritivo y/o agar Burk), ya sea individual o en mezcla en cuyo caso se realizó con base a la relación 1:1 1x10⁶ UFC/mL/semilla con la misma densidad de A. vinelandii y B. subtilis, luego las semillas se sembraron en 1.0 kg de suelo en la parte superior del sistema hidropónico de Jarras de Leonard (Figura 1)²⁰, mientras que en la inferior se colocó la solución mineral con la siguiente composición química (g/L): NH₄NO₃ 12.0, KH₂PO₄ 3.0, K₂HPO₄ 3.5, MgSO₄ 1.5, CaCl₂ 0.1, FeSO₄ 0.5 mL/L, y 1.0 ml/L de la solución de oligoelementos: (g/L), H₃BO₃ 2.86, ZnSO₄*7H₂O 0.22, MnCl₂*7H₂O 1.81, K₂MnO₄ 0.09, el pH se ajustó a 7.0, en agua destilada, mientras que el NH₄NO₃ se redujo al 50 % equivalente a 6 g/L²¹.

El ensayo se realizó de acuerdo con la Tabla 1, donde se muestra el diseño experimental de bloques al azar con 3 tratamientos, 2 controles y 6 repeticiones: T. aestivum irrigado con agua o control absoluto (CA), el crecimiento de T. aestivum con alimentado con la dosis de FN al 100 % o control relativo (CR), crecimiento de T. aestivum con A. vinelandii y/o B. subtilis con el FN al 50 %. Para analizar el crecimiento T. aestivum con A. vinelandii y/o B. subtilis a nivel de plántula y floración con el FN al 50 %, mediante las variables respuestas: porciento de germinación y biomasa: peso fresco aéreo y radical (PFA/PFR), peso seco aéreo y radical (PSA/PSR) a plántula y floración²².

Para demostrar que A. vinelandii y/o B. subtilis fueron responsable del efecto positivo en T. aestivum ambos se recuperaron en agar Burk y AN, a partir de la desinfección de externa de las raíces de T. aestivum, a floración se usó el perfil de sensibilidad de antibióticos de cada una²⁰. Los datos experimentales se validaron con ANOVA/Tukey HSD P<0.05 % con el programa estadístico Statgraphics Centurion²³.

Resultados

En la Tabla 2, se muestra la respuesta positiva de las semillas de T. aestivum con A. vinelandii y B. subtilis con el FN al 50 %, donde se registró el 100 % de germinación, valor numérico con diferencia estadística comparado con el 95.8 % de T. aestivum con A. vinelandii y el FN al 50 %, así como con el 79.1 % de T. aestivum sin A. vinelandii y B. subtilis alimentado con el FN al 100 % o CR.

En la Tabla 3, se muestra a plánula el crecimiento de T. aestivum con A. vinelandii y B. subtilis con el FN al 50 %, donde se registró 0.27 g de PFA y 0.13 g de PFR, ambos valores numéricos tuvieron diferencia estadística comparado con los 0.14 g de PFA y los 0.08 g de PFA de T. aestivum con B. subtilis y el FN al 50 %, en comparación con los 0.24 g de PFA y los 0.11 g de PFA de T. aestivum sin A. vinelandii y/o B. subtilis alimentado con el FN al 100 % o CR. En tanto que, en el peso seco, el crecimiento de T. aestivum con A. vinelandii plus B. subtilis y el FN 50 %, registró 0.17 g de PSA un valor numérico estadísticamente diferente a los 0.15 g de PSR de T. aestivum usado como CR.

En la Tabla 4 se muestra a nivel de floración la respuesta positiva de T. aestivum a A. vinelandii plus B. subtilis con el FN 50 %, ahí hubo un registró de 6.58 g de PFA y 0.65 g de PFR, ambos valores numéricos estadísticamente diferentes en comparación con los 0.97 g de PFA y los 0.57 g de PFA del crecimiento de T. aestivum con B. subtilis y el FN al 50 %, así como con los 1.80 g de PFA y los 0.32 g de PFA del crecimiento de T. aestivum sin A. vinelandii y/o B. subtilis alimentado con el FN al 100 % o CR, en cuyo caso el crecimiento de T. aestivum indica que la absorción del FN al 100% por las raíces, fue inferior a lo registrado en los valores de la biomasa de T. aestivum tratado con A. vinelandii y/o B. subtilis con el FN al 50% que registró 1.64 g de PSA y 0.39 g de PSR, ambos valores numéricos tuvieron diferencia estadística comparado con los 0.61 g de PSA y los 0.22 g de PSR de T. aestivum sin A. vinelandii y B. subtilis y el FN al 100% usado como CR.

Discusión

En la Tabla 2, el efecto positivo de A. vinelandii y/o B. subtilis endófitas de teocinte en la germinación de las semillas de T. aestivum con el FN al 50 %, indica que las semillas al embeber agua, indujeron la máxima actividad de la α-amilasa para la rápida hidrolisis del almidón^24,25, en consecuencia se liberaron algunos azucares sencillos, ácidos orgánicos, aminoácidos, etc., productos de la degradación del endospermo de la semilla que tanto A. vinelandii y/o B. subtilis, transformaron en fitohormonas del tipo: giberelinas que aceleraron la emergencia de un mayor cantidad de semillas de T. aestivum^{20 , 26,27}, con valores en el porciento de germinación que fueron estadísticamente diferentes a los registrados en el porciento de germinación de T. aestivum sin A. vinelandii y/o B. subtilis con el FN al 100 % usado como CR.

Los datos expuestos en la Tabla 3, señalan que a nivel de plántula se observó un crecimiento sano de T. aestivum con A. vinelandii y B. subtilis endófitos de teocintle con el FN al 50 %, lo que indica que después de la germinación, A. vinelandii y B. subtilis invadieron el primordio de raíz, para una máxima absorción del FN a pesar de reducirlo al 50 % al evitar la competencia externa con otros géneros y especies de BPCV autóctonas del suelo donde se sembró el T. aestivum. Mientras que los valores numéricos en función de la biomasa del crecimiento de T. aestivum cuando se inoculo con A. vinelandii y B. subtilis apoyan que ambos endófitos colonizaron el interior del sistema radical del T. aestivum, sitio donde A. vinelandii y B. subtilis transforman de algunos compuestos de carbono de la fotosíntesis en fitohormonas del tipo auxinas^28,29, que inducen el crecimiento abundante del tejido radical, con aumento de la capacidad del área de exploración de esas raíces, lo que facilito la máxima absorción del FN y la optimización de la dosis reducida al 50 % sin riesgo de comprometer el sano crecimiento de T. aestivum^30-32.

En la Tabla 4, a nivel de floración los datos numéricos registrados de la biomasa: peso fresco y seco de la parte área y radical del crecimiento e de T. aestivum con A. vinelandii y/o B. subtilis indican que A. vinelandii como B. subtilis endófitas de teocintle, primero tuvieron la capacidad de invadir el primordio de raíz para llegar al xilema, en donde se sugiere que mediante la conversión de algunos compuestos orgánicos derivados de la fotosíntesis en fitohormonas: auxinas y citocininas, se observó un sistema radical denso y abundante que favoreció la optimización del FN al 50 %^28,33. En la literatura se reporta que los géneros y especies de bacterias endófitas como A. vinelandii y/o B. subtilis al invadir el interior del tejido radical, evitaron la competencia⁷ externa con los microorganismos del suelo, que tienen capacidad de colonizar del rizoplano y/o la rizosfera, pero que no necesariamente son benéficos para el sano crecimiento de T. aestivum en especial cuando se restringe la dosis del FN^34,35. Con base a lo anterior se concluye que A. vinelandii y B. subtilis endófitas del teocintle tuvieron potencial de colonizar el interior de las raíces de T. aestivum, puesto que individualmente o en mezcla A. vinelandii como B. subtilis de acuerdo con las datos de la fenología y biomasa mostraron que tienen la capacidad de convertir fitohormonas que aumentaron la absorción radical para la optimización del FN al 50 % sin comprometer el saludable crecimiento de T. aestivum. Mientras que A. vinelandii y/o B. subtilis se recuperaron en agar Burk y AN del interior de las raíces de T. aestivum, a floración, pero no ninguna se detectó en las raíces de T. aestivum usado como CR. Con lo cual se aporta información de otra opción para la producción sustentable de T. aestivum.